Механическая диссоциация: метод получения жизнеспособных клеток из ткани

Overview

Это видео описывает не-энзиматической диссоциации свежих человеческих тканей для получения жизнеспособных клеток. Методика используется для качественного и количественного анализа положительных клеток CD45 (лимфоцитов/лейкоцитов), присутствующих в различных нормальных и злокачественных тканях человека.

Protocol

1. Подготовка гомогената тканей

1. Рассеченные ткани (злокачественные и нормальные ткани, ресектированные из операционной) находятся в лаборатории патологии обученным персоналом для немедленного пикапа. Опухоль, НАНТ (взятые на расстояние от опухоли, насколько это возможно) и нормальные фрагменты тканей обычно обрабатываются в течение 1 - 3 часов хирургического иссечения в лаборатории BSL2 с использованием стандартных процедур биобезопасности для тканей человека. Диаграмма потока протокола иллюстрируется на рисунке 1.
2. Взвесьте все фрагменты тканей (нормальные, NANT и опухоли) и измерить длину, ширину и высоту (длина х ширина х высота). Это важный шаг для последующей нормализации подпопуляций клеток, извлеченной РНК и т.д.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон размера выборки составляет от 100 до 10000 мм^{3 без жира,} если это возможно.
3. Отпечаток фрагмента опухоли на стеклянной горке для Окрашивания Н И Е, чтобы убедиться, что ткань на самом деле является частью опухоли.
   1. Сделайте это, нажав стеклянный микроскоп слайд на фрагмент опухоли и применения мягкого давления пальцами в течение нескольких секунд.
   2. Исправить слайд с изопропанолом в течение 2 минут, а затем стиральная шаг в воде. Счетчик ткани в течение 30 сек с гематоксилин Майера.
   3. Вымойте горку в шести ваннах с водой. Пятно в Phloxine B 2% в течение 15 сек.
   4. Вымойте в одной ванне воды следуют четыре ванны изопропанола и закончить с одной баней воды.
   5. Инкубировать в изопропанол в течение 1 мин и процедить. Очистить в двух ваннах ксилена.
   6. Гора с ксиленом на основе монтажа среды. Изучение клеточной опухоли(рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Главным образом, опухолевые клетки прилипают к отпечатаемому слайду - стромальные, лимфоидные или жировые клетки редко остаются, оставляя пробелы между опухолевыми клетками(рисунок 2).
4. Поместите фрагмент ткани в небольшую культурную тарелку, содержащую 1 мл химически определенной, без сыворотки гематопоэтической клеточной среды (далее именуемой средней) при комнатной температуре и нарежьте ее на мелкие кусочки (1 -^{2 мм 2)}с помощью стерильного скальпеля.
5. Перенесите все (фрагменты тканей и средний) в механическую диссоциаторную трубку C.
6. Промыть чашку Петри и скальпель с 2 мл среды с помощью пастер пипетки и добавить это в трубку C (объем среды для диссоциации 3 мл).
7. Используйте программу механического диссоциатора A.01 для C-труб (самая нежная программа) для гомогенизации фрагментов тканей в одноклеточную подвеску. Поместите трубку C в аппарат и запустите программу дважды подряд (один цикл - 25 сек).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура гомогенизации была создана и проверена для ткани молочной железы человека, других типов опухолей или тканей, возможно, потребуется использовать другую программу и должны быть проверены в первую очередь.
8. Удалите трубку C из аппарата и декантировать гомогенат непосредственно в 40 мкм ситечко клеток, сидящих на 50 мл трубки. Используя ту же трубу Pasteur, что и в шаге 1.6,перенесите любую жидкость, оставшуюся в трубке C, в ситечко клетки.
9. Перенесите фильтрованную жидкость в трубку 15 мл с помощью наконечника микропипетта 1 мл. Временно держите клеточный ситечко и его 50 мл трубки.
10. Промыть трубку C с дополнительными 3 мл среды и передать это, опять же с помощью той же трубы Пастера, как в шаге 1,6, к клетке ситечко еще сидит на 50 мл трубки. Сожмите максимальное количество остаточной жидкости, попав в неоднородную ткань, в трубку 50 мл, аккуратно перемещая ее вокруг ситечко с чистой трубой Pasteur или 1 мл наконечником, который впоследствии выбрасывается, чтобы избежать загрязнения элуата.
11. Поместите ситечко клетки вверх дном на оригинальную трубку C и промойте 3 мл среды так, чтобы неоднородная ткань упала обратно в трубку C.
12. Ре-гомогенизации, как в шаге 1.7 в течение двух циклов программы A.01.
13. Налейте этот второй гомогенат через клеточный ситечко, сидящий на 50 мл трубки, промыть трубку C снова с 3 мл среды (как в шаге 1.10) и передачи с Пастер пипетки к клетке ситечко сидит на 50 мл трубки снова сжимая максимальное количество жидкости из остаточной соединительной ткани, оказавшихся в клетке ситечко.
14. На данный момент объем 2,5 мл находится в трубке 15 мл и 9 мл в 50 мл трубки.

2. Разделение ткани supernatant и клеток

1. Центрифуга гомогенатов в 15 мл и 50 мл труб в течение 15 мин при 600 х г при комнатной температуре.
2. Decant SN из 15 мл трубки в чистую трубку и временно хранить при 4 градусов по Цельсию. Эта супернатантная первичная опухоль, НАНТ или нормальная ткань SN (окончательный объем 2,5 мл) впоследствии проясняется и алицитирована перед хранением при -80 градусов по Цельсию для будущих анализов (см. ниже).
3. Откажитесь от супернатанта из 50 мл трубки.
4. Аккуратно повторно посовекуйте обе клеточные гранулы в итоговом объеме 1 мл среды. Короче говоря, сначала осторожно разорвать ячейки гранулы в обеих трубках (нажав трубку на твердой поверхности). Resuspend свободные гранулы клетки в 50 мл с 500 мкл среды и передачи этой клеточной подвески на 15 мл трубки для повторного перерасхода второй гранулы. Повторите этот шаг один раз со вторыми 500 мкл среды для максимального восстановления клеток.
5. Перенесите 10 мкл клеточной подвески в небольшую трубку, смешайте с 10 мкл трипан-голубого (разбавление 1:1) и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент часть клеточной суспензии также может быть проанализирована цитометрией потока для оценки размера клетки, детализации и при желании ограниченного числа маркеров субпопуляции для более точной оценки относительного распределения клеток в гомогенате до обширного анализа или экспериментов. Все анализы по цитометрии потока включают маркировку CD45 для нормализации субпопуляций.
6. Пеллет клеток центрифугации при температуре 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки опухоли, NANT или нормальной ткани теперь готовы к дальнейшей очистке или анализу. Эти дополнительные шаги лучше всего выполнять в тот же день, как операция.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для цитометрического анализа потока, но не сортировки клеток остаточные красные кровяные тельца должны быть лизированы после маркировки антител, добавив 0,4 мл буфера лиза красных кровяных телец к клеточной грануле, немедленно вихревой в течение 1 сек и инкубации минимум 10 мин при комнатной температуре (защищенной от света) до анализа.

3. Уточнение ткани Supernatant

1. Центрифуга 1,5 мл трубок с тканью SN при 15000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
2. Аккуратно удалите супернатант, не касаясь и не нарушая гранулы. Передача в чистую трубку (или трубки) в зависимости от количества и объема желаемых алиментов.
3. Храните супернатант при -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.

Representative Results

Рисунок 1: Диаграмма потока протокола. Показана наша процедура обработки свежих тканей человека и некоторые аналитические подходы, которые впоследствии могут быть использованы для оценки лимфоцитов, проникающих в ткани человека.

Рисунок 2: H и E окрашенных изображение отпечатка опухолевой ткани молочной железы. Этот отпечаток, взятый из свежего фрагмента опухолевой ткани молочной железы, показывает наличие опухолевых клеток с открытыми пространствами, отражающими области, которые не были переданы.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain