机械分离：从组织中获取活细胞的方法

Overview

此视频描述了新鲜人体组织获得可行细胞的非酶分离。该技术用于对各种正常和恶性人体组织中存在的CD45正细胞（淋巴细胞/白细胞）进行定性和定量分析。

Protocol

1. 组织同质素的制备

1. 解剖被解剖的组织（从手术室解剖的恶性和正常组织）由训练有素的人员在病理实验室进行立即取样。肿瘤、NANT（尽可能远离肿瘤）和正常组织片段在BSL2实验室使用标准的人体组织生物安全程序在手术切除的1-3小时内进行常规处理。协议的流程图在图 1中说明。
2. 称重所有组织片段（正常、NANT 和肿瘤），测量长度、宽度和高度（长度 x 宽度 x 高度）。这是细胞亚种群、提取RNA等后续正常化的重要一步。
   注： 样本大小范围为 100 至 10，000 mm^3，如果可能，不具有脂肪。
3. 将肿瘤片段印在玻璃滑梯上，用于 H&E 染色，以验证组织实际上是肿瘤的一部分。
   1. 通过将玻璃显微镜滑动在肿瘤碎片上，用手指施加微压几秒钟来达到此点。
   2. 用异丙酚修复滑梯2分钟，然后在水中洗涤一步。用迈尔的血氧林将组织反污30秒。
   3. 在六个水浴池中清洗滑梯。染色素 B 2% 15 秒。
   4. 洗一个水浴，然后四个浴的异丙酚，并完成一个洗澡的水。
   5. 在异丙酚中孵育1分钟，然后排干。在两个浴池中清除二甲苯。
   6. 安装基于二甲苯的安装介质。检查肿瘤细胞（图2）。
      注：主要是，肿瘤细胞粘在印迹滑梯上 - 频闪、淋巴类或脂肪细胞很少存在，在肿瘤细胞之间留下空间（图2）。
4. 在室温下将组织片段放入含有 1 毫升化学定义的无血清造血细胞介质（以下简称中等）的小培养皿中，然后使用无菌手术刀将其切成小块（=1 - 2 mm^2）。
5. 将所有内容（组织片段+中等）传输到机械分离器 C 管中。
6. 使用巴斯德移液器用 2 毫升介质冲洗培养皿和手术刀，并将此添加到 C 管中（用于分离的介质体积 = 3 毫升）。
7. 使用机械分离器程序 A.01 用于 C 管（最温和的程序），将组织片段同质化为单个细胞悬架。将 C 管放在仪器中，并连续运行两次程序（一个周期 = 25 秒）。
   注： 这种同质化程序已经为人类乳房组织建立和验证，其他肿瘤或组织类型可能需要使用不同的程序，应首先进行测试。
8. 从仪器中取出 C 管，将同质性直接排入坐在 50 毫升管上的 40μm 细胞过滤器中。使用与步骤 1.6相同的巴斯德移液器，将 C 管中剩余的任何液体转移到细胞过滤器中。
9. 使用 1 毫升微皮尖将过滤后的液体转移到 15 毫升管中。暂时保持细胞过滤器及其50毫升管。
10. 用额外的3毫升介质冲洗C管，并再次使用与步骤1.6相同的巴斯德移液器，将C管转移到仍坐在50毫升管上的细胞过滤器。用干净的巴斯德移液器或 1 毫升尖端轻轻移动过滤器，将困在未激素组织中的剩余液体的最大量挤压到 50 毫升管中，以避免污染物化。
11. 将细胞过滤器倒置在原来的C管上，用3毫升的介质冲洗，使未生长的组织重新回到C管中。
12. 在 A.01 计划的两个周期中，将步骤 1.7重新同质化。
13. 将第二个同质化物倒入坐在50毫升管上的细胞过滤器中，用3毫升介质（如步骤1.10）再次冲洗C管，然后用巴斯德移液器转移到坐在50毫升管上的细胞过滤器，再次挤压被困在细胞过滤器中的残余结缔组织的最大液体量。
14. 此时，15 毫升管中的体积为 2.5 毫升，50 毫升管中的体积为 9 毫升。

2. 组织超分子和细胞分离

1. 在室温下，在 600 x g 下，在 15 毫升和 50 毫升管中分流同质物 15 分钟。
2. 将 SN 从 15 毫升管中分离到干净的管中，并暂时存储在 4 °C。 此超自然 = 原发性肿瘤、NANT 或正常组织 SN（最终体积 2.5 毫升）随后在储存在 -80 °C 之前进行澄清和引用，以便将来进行分析（见下文）。
3. 从 50 毫升管中丢弃超自然。
4. 在 1 毫升介质的最终体积中轻轻补充两个细胞颗粒。简言之，首先轻轻打破两个管子中的细胞颗粒（通过在坚硬的表面上敲击管子）。用 500 μl 的介质将松散的细胞颗粒在 50 毫升中补充，并将此细胞悬架转移到 15 毫升管中以补充第二个颗粒。使用第二个 500 μl 的介质重复此步骤一次，以最大限度地恢复细胞。
5. 将细胞悬架的 10μl 转移到一个小管中，与 10μl 的尝试蓝（稀释 1：1）混合，并使用血细胞计计算可行细胞的数量。
   注： 此时，也可以通过流动细胞学分析细胞悬浮的一小部分，以评估细胞大小、粒度以及是否需要数量有限的亚人口标记，以便在广泛分析或实验之前更精确地评估同质体中的相对细胞分布。所有按流动细胞学进行的分析都纳入了CD45标签，用于亚人口正常化。
6. 在室温下以300 x g的离心机将细胞分丸10分钟。肿瘤、NANT 或正常组织的细胞现已准备好进一步纯化或分析。这些额外的步骤最好在手术的同一天进行。
   注： 对于流动细胞学分析，但不进行细胞分类，残留的红血球应在抗体标记后裂解，在细胞颗粒中加入0.4毫升红血球裂解缓冲器，立即漩涡1秒，并在分析前在室温下孵育至少10分钟（防止光线照射）。

3. 组织超强剂的澄清

1. 离心器 1.5 毫升管与组织 Sn 在 15，000 x g 15 分钟在 4 °C.
2. 小心地去除超细剂，而不会接触或干扰颗粒。根据所需的阿里报价的数量和体积，转移到干净的管子（或管子）。
3. 将超自然人储存在-80°C，供将来使用。

Representative Results

图1：协议流程图。我们处理新鲜人体组织的程序以及随后可用于评估渗透人体组织的淋巴细胞的一些分析方法显示出来。

图2：乳腺肿瘤组织印记的H&E染色图像。这个印记取自新鲜的乳腺肿瘤组织片段，显示了肿瘤细胞的存在，其开放空间反映了未转移的区域。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain