機械的解離:組織から生存細胞を得る方法

Overview

このビデオでは、生き生き細胞を得るために新鮮なヒト組織の非酵素的解離について説明します。この技術は、様々な正常および悪性ヒト組織に存在するCD45陽性細胞(リンパ球/白血球)の定性的および定量的分析に使用される。

Protocol

1. 組織ホモジネートの調製

1. 切除された組織(手術室から切除された悪性および正常な組織)は、即時ピックアップのための訓練を受けた人員によって病理学の実験室にある。腫瘍、NANT(可能な限り腫瘍から最も遠い距離を取った)および正常な組織断片は、ヒト組織の標準的な生体安全手順を使用してBSL2実験室で外科的切除の1〜3時間以内に日常的に処理される。図1に、プロトコルのフローチャートを示します。
2. すべての組織断片(正常、NANTおよび腫瘍)を秤量し、長さ、幅、および高さ(長さx幅x高さ)を測定する。これは、細胞の亜集団、抽出されたRNAなどのその後の正規化のための重要なステップです。
   注: サンプルサイズの範囲は、可能であれば脂肪なしで100〜10,000 mm³です。
3. H&E染色のためにガラススライドに腫瘍断片を刻印し、組織が実際に腫瘍の一部であることを確認する。
   1. これを行うには、腫瘍片のガラス顕微鏡スライドを押し、数秒間指で穏やかな圧力を加えます。
   2. 2分間イソプロパノールでスライドを固定し、水に洗浄ステップを入れます。マイヤーのヘマトキシリンで30秒間組織に対抗する。
   3. 6つの水浴でスライドを洗います。フロキシンB 2%の15秒間のステイン。
   4. 1浴中の水で洗い、続いてイソプロパノールを4浴し、1浴で仕上げます。
   5. イソプロパノールで1分間インキュベートし、ドレインします。キシレンの2つの風呂でクリア。
   6. キシレンベースの取り付け媒体でマウントします。腫瘍細胞性を調べる(図2)。
      注:主に、腫瘍細胞は、転置されたスライドに付着する - 間質、リンパ腫または脂肪細胞はほとんど残って、腫瘍細胞の間にスペースを残す(図2)。
4. 組織断片を化学的に定義された1mlを含む小さな培養皿に入れて、無血清造血細胞培地(以下、培地といいます)を室温で、滅菌メスを用いて小片(〜1~2mm2)にダイスする。
5. すべてを(組織断片+媒体)機械解離器Cチューブに移します。
6. パスツールピペットを使用してペトリ皿とメスを2mlの培地で洗い、これをCチューブ(解離用培地の体積= 3ml)に加えます。
7. Cチューブ(最も穏やかなプログラム)の機械的解離プログラムA.01を使用して、組織断片を単一の細胞懸濁液に均質化します。Cチューブを装置に入れ、プログラムを2回連続して実行します(1サイクル= 25秒)。
   注: この均質化手順は、ヒト乳房組織について確立および検証されており、他の腫瘍または組織タイプは別のプログラムを使用する必要があり、最初に試験されるべきである。
8. 装置からC管を取り出し、50mlチューブに装着した40μmのセルストレーナーに直接ホモゲネートをデカントします。ステップ1.6と同じパスツールピペットを使用して、Cチューブに残っている液体を細胞ストレーナーに移します。
9. 1 ml マイクロピペットチップを使用して、濾過した液体を 15 ml チューブに移します。一時的に細胞のストレーナーとその50のmlの管を保ってください。
10. さらに3mlの培地でCチューブをリンスし、ステップ1.6と同じパスツールピペットを使用して、50mlチューブにまだ座っている細胞ストレーナーにこれを移します。非均質化した組織に閉じ込められた残留液の最大量を50mlチューブに絞り、きれいなパスツールピペットまたは1mlの先端を清浄なパスツールピペットでストレーナーの周りにそっと動かし、溶出物を汚染しないようにします。
11. 細胞ストレーナーを元のCチューブに逆さまに置き、3mlの培地でリンスし、不均質化した組織がCチューブに戻るようにします。
12. A.01 プログラムの 2 サイクルのステップ 1.7のように再ホモジナイズします。
13. 50mlチューブに装着した細胞ストレーナーを通してこの2番目のホモジネートを注ぎ、Cチューブを3ml培地(ステップ1.10のように)で再びすすいで、パスツールピペットを50mlチューブに座った細胞ストレーナーに移し、細胞ストレーナーに閉じ込められた残留結合組織から最大量の液体を再び絞ります。
14. この時点で、〜2.5mlの体積は、50mlチューブ内の15mlチューブおよび〜9ml内にある。

2. 組織上清と細胞の分離

1. 室温で600 x gで15分間、15 mlおよび50 mlの管にホモジェナートを遠心する。
2. 15mlチューブからSNを清浄なチューブにデカントし、4°Cで一時的に保管します。 この上清=原発性腫瘍、NANTまたは正常組織SN(最終容積2.5ml)は、将来の分析のために-80°Cで貯蔵する前に明らかにされ、アリクォートされる(下記参照)。
3. 50mlチューブから上清を捨てます。
4. 2つの細胞ペレットを最終体積1ml培地で静かに再懸濁します。簡単に言えば、まず、両方のチューブの細胞ペレットを穏やかに壊します(硬い表面のチューブをタップします)。500 μlの培地で50mlの緩い細胞ペレットを再懸濁し、この細胞懸濁液を15mlチューブに移して2番目のペレットを再懸濁します。このステップを2番目の500 μlの培地で1回繰り返して、細胞を最大に回収します。
5. 細胞懸濁液10μlを小さなチューブに移し、10μlのトリパンブルー(希釈1:1)と混合し、ヘモサイトメーターを使用して生存細胞の数を数えます。
   注: この時点で細胞懸濁液の一部をフローサイトメトリーで分析して、広範な分析または実験の前にホモジュネートにおける相対的な細胞分布をより正確に評価するために、細胞サイズ、粒度および所望な限られた数の個体数マーカーを評価することもできる。フローサイトメトリーによるすべての解析には、サブ集団の正規化のためのCD45ラベリングが組み込まれています。
6. ペレット細胞は、室温で10分間300xgで遠心分離して細胞をペレット化した。腫瘍、NANT、または正常組織からの細胞は、さらなる精製または分析の準備が整いました。手術と同じ日に実行する場合、これらの追加の手順が最適です。
   注: フロー細胞量分析では、細胞ペレットに0.4mlの赤血球リシスバッファーを添加し、すぐに1秒間ボルテックスし、分析前に室温(光から保護)で最低10分間インキュベートすることにより、抗体標識後に細胞を選別しない。

3. 組織上清の明確化

1. 遠心分離機組織SNを有する1.5mlチューブを15,000 x gで4°Cで15分間遠心分離する。
2. ペレットに触れたり、邪魔したりすることなく、上清を慎重に取り除いてください。所望のアリコートの数と量に応じて、きれいなチューブ(またはチューブ)に移す。
3. 上清は-80°Cで保管し、今後の使用に向けておきます。

Representative Results

図 1: プロトコルのフローチャート新鮮なヒト組織を処理するための我々の手順と、その後、ヒト組織に浸潤するリンパ球を評価するために使用できるいくつかの分析アプローチが示されている。

図2:H&E染色された乳房腫瘍組織の印字画像。このインプリントは、新鮮な乳房腫瘍組織断片から採取され、転化されなかった領域を反射する開放空間を有する腫瘍細胞の存在を示す。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain