Disociación mecánica: un método para obtener células viables de un tejido

Overview

Este video describe la disociación no enzimática del tejido humano fresco para obtener células viables. La técnica se utiliza para el análisis cualitativo y cuantitativo de células positivas CD45 (linfocitos/leucocitos) presentes en varios tejidos humanos normales y malignos.

Protocol

1. Preparación del homogeneato de tejido

1. La disección de tejidos resecados (tejido maligno y normal reseccionado del quirófano) se encuentran en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Tumor, NANT (tomado la distancia más alejada del tumor como sea posible) y fragmentos de tejido normales se procesan rutinariamente dentro de 1 - 3 horas de escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 utilizando procedimientos estándar de bioseguridad para tejidos humanos. Se ilustra un diagrama de flujo del protocolo en la Figura 1.
2. Pesar todos los fragmentos de tejido (normal, NANT y tumor) y medir la longitud, anchura y altura (longitud x anchura x altura). Este es un paso importante para la posterior normalización de subpoblaciones celulares, ARN extraído, etc.
   NOTA: El rango de tamaño de la muestra es de 100 a 10.000 mm³ sin grasa si es posible.
3. Imprima el fragmento tumoral en una diapositiva de vidrio para la tinción de H&E para verificar que el tejido es realmente parte del tumor.
   1. Haga esto presionando una diapositiva de microscopio de vidrio en el fragmento del tumor y aplicando presión suave con los dedos durante unos segundos.
   2. Fije el tobogán con isopropanol durante 2 minutos seguido de un paso de lavado en agua. Contrarresta el tejido durante 30 s con la hematoxilina de Mayer.
   3. Lave el tobogán en seis baños de agua. Mancha en Phloxine B 2% durante 15 s.
   4. Lavar en un baño de agua seguido de cuatro baños de isopropanol y terminar con un baño de agua.
   5. Incubar en isopropanol durante 1 min y drenar. Despejado en dos baños de xileno.
   6. Monte con medio de montaje a base de xileno. Examinar la celularidad tumoral (Figura 2).
      NOTA: Principalmente, las células tumorales se adhieren a la diapositiva impresa - las células estromales, linfoides o adiposas rara vez permanecen, dejando espacios entre las células tumorales (Figura 2).
4. Coloque el fragmento de tejido en un plato de cultivo pequeño que contenga 1 ml del medio celular hematopoyético libre de suero definido químicamente (en adelante, medio) a temperatura ambiente y lácelo en trozos pequeños (~1 - 2 mm²⁾usando un bisturí estéril.
5. Transfiera todo (fragmentos de tejido + medio) a un tubo C disociador mecánico.
6. Enjuague la placa De Petri y el bisturí con 2 ml de medio usando una pipeta Pasteur y agréguelo al tubo C (volumen de medio para la disociación = 3 ml).
7. Utilice el programa de disociador mecánico A.01 para tubos C (el programa más suave) para homogeneizar los fragmentos de tejido en una sola suspensión celular. Coloque el tubo C en el aparato y ejecute el programa dos veces seguidas (un ciclo = 25 s).
   NOTA: Este procedimiento de homogeneización se ha establecido y validado para el tejido mamario humano, otros tipos de tumores o tejidos pueden necesitar utilizar un programa diferente y deben hacerse la prueba primero.
8. Retire el tubo C del aparato y decante el homogeneizado directamente en un colador de células de 40 μm sentado en un tubo de 50 ml. Usando la misma pipeta Pasteur que en el paso 1.6,transfiera cualquier líquido restante en el tubo C al colador celular.
9. Transfiera el líquido filtrado a un tubo de 15 ml utilizando una punta de micropipette de 1 ml. Mantenga temporalmente el colador celular y su tubo de 50 ml.
10. Enjuague el tubo C con 3 ml adicionales de medio y transfiéralo, de nuevo utilizando la misma pipeta Pasteur que en el paso 1.6,al colador celular todavía sentado en el tubo de 50 ml. Exprime una cantidad máxima del líquido residual atrapado en el tejido nohomogenizado en el tubo de 50 ml moviéndolo suavemente alrededor del colador con una pipeta Pasteur limpia o una punta de 1 ml que posteriormente se tira para evitar contaminar el eluato.
11. Coloque el colador celular boca abajo en el tubo C original y enjuague con 3 ml de medio para que el tejido nohomogenizado vuelva a caer en el tubo C.
12. Re-homogeneizar como en el paso 1.7 para dos ciclos del programa A.01.
13. Vierta este segundo homogeneizado a través del colador celular sentado en el tubo de 50 ml, enjuague el tubo C de nuevo con 3 ml de medio (como en el paso 1.10)y transfiera con la pipeta Pasteur al colador celular sentado en el tubo de 50 ml de nuevo exprimiendo una cantidad máxima de líquido del tejido conectivo residual atrapado en el colador celular.
14. En este punto, un volumen de ~ 2.5 ml está en el tubo de 15 ml y ~ 9 ml en el tubo de 50 ml.

2. Separación del sobrenadante de tejidos y las células

1. Centrífuga los homogeneatos en los tubos de 15 ml y 50 ml durante 15 min a 600 x g a temperatura ambiente.
2. Decantar la SN del tubo de 15 ml en un tubo limpio y almacenar temporalmente a 4 °C. Este sobrenadante = tumor primario, NANT o SN de tejido normal (volumen final 2,5 ml) se aclara posteriormente y se acuarcita antes del almacenamiento a -80 °C para futuros análisis (ver más abajo).
3. Deseche el sobrenadante del tubo de 50 ml.
4. Resuspend suavemente ambos pellets celulares en un volumen final de 1 ml de medio. Brevemente, primero rompa suavemente el pellet celular en ambos tubos (tocando el tubo en una superficie dura). Resuspend el pellet de celda suelta en los 50 ml con 500 μl de medio y transferir esta suspensión celular al tubo de 15 ml para resuspend el segundo pellet. Repita este paso una vez con el segundo 500 μl de medio para la máxima recuperación de las células.
5. Transfiera 10 μl de la suspensión celular a un tubo pequeño, mezcle con 10 μl de azul tripán (dilución 1:1) y cuente el número de células viables utilizando un hemociclo.
   NOTA: En este punto, una fracción de la suspensión celular también se puede analizar mediante citometría de flujo para evaluar el tamaño de la célula, la granularidad y, si se desea, un número limitado de marcadores de subpoblación para una evaluación más precisa de la distribución celular relativa en el homogeneato antes de un análisis o experimentación extenso. Todos los análisis por citometría de flujo incorporan etiquetado CD45 para la normalización de subpoblaciones.
6. Peletizar las células por centrifugación a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células del tumor, NANT o tejido normal ya están listas para su posterior purificación o análisis. Estos pasos adicionales son mejores cuando se realizan el mismo día que la cirugía.
   NOTA: Para el análisis citométrico de flujo, pero no la clasificación celular de los glóbulos rojos residuales debe ser lysed después del etiquetado de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos a la pedacito, vórtice inmediato durante 1 s e incubar un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente (protegido de la luz) antes del análisis.

3. Aclaración del sobrenadante de tejidos

1. Centrífuga los tubos de 1,5 ml con SN tisular a 15.000 x g durante 15 minutos a 4 °C.
2. Retire cuidadosamente el sobrenadante sin tocar o perturbar el pellet. Transferir a un tubo limpio (o tubos) dependiendo del número y volumen de alícuotas deseados.
3. Almacene el sobrenadante a -80 °C para uso futuro.

Representative Results

Figura 1: Gráfico de flujo de protocolo. Se muestra nuestro procedimiento para procesar tejidos humanos frescos y algunos enfoques analíticos que posteriormente se pueden utilizar para evaluar los linfocitos que se infiltran en los tejidos humanos.

Figura 2: Imagen manchada de H&E de una huella de tejido tumoral mamario. Esta huella, tomada de un fragmento fresco del tejido tumoral mamario, muestra la presencia de células tumorales con los espacios abiertos que reflejan áreas que no fueron transferidas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain