Dissociação Mecânica: Um Método para Obter Células Viáveis de um tecido

Overview

Este vídeo descreve a dissociação não enzimática do tecido humano fresco para obter células viáveis. A técnica é utilizada para análise qualitativa e quantitativa de células positivas CD45 (linfócitos/leucócitos) presentes em diversos tecidos humanos normais e malignos.

Protocol

1. Preparação do homogeneizar tecido

1. Os tecidos dissecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para coleta imediata. Tumor, NANT (retirados da maior distância possível do tumor) e fragmentos normais de tecido são rotineiramente processados dentro de 1 - 3 horas de excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 usando procedimentos padrão de biossegurança para tecidos humanos. Um fluxograma do protocolo é ilustrado na Figura 1.
2. Pesar todos os fragmentos de tecido (normal, NANT e tumor) e medir o comprimento, largura e altura (comprimento x largura x altura). Este é um passo importante para a posterior normalização das subpopulações celulares, RNA extraído, etc.
   NOTA: A faixa de tamanho amostral é de 100 a 10.000 mm³ sem gordura, se possível.
3. Imprimi o fragmento do tumor em uma lâmina de vidro para coloração de H&E para verificar se o tecido é realmente parte do tumor.
   1. Faça isso pressionando um microscópio de vidro deslizando sobre o fragmento do tumor e aplicando pressão suave com os dedos por alguns segundos.
   2. Fixar o slide com isopropanol por 2 min seguido de um passo de lavagem na água. Contra-retenham o tecido por 30 segundos com a hematoxilina de Mayer.
   3. Lave o escorregador em seis banhos de água. Mancha em Phloxine B 2% por 15 segundos.
   4. Lave em um banho de água seguido de quatro banhos de isopropanol e finalize com um banho de água.
   5. Incubar em isopropanol por 1 min e drenar. Limpe em dois banhos de xileno.
   6. Monte com meio de montagem à base de xileno. Examine a celularidade tumoral(Figura 2).
      NOTA: Principalmente, as células tumorais grudam no slide impresso - as células estromâneas, linfoides ou adiposas raramente permanecem, deixando espaços entre as células tumorais(Figura 2).
4. Coloque o fragmento de tecido em um pequeno prato de cultura contendo 1 ml do meio de célula hematopoiética quimicamente definido e livre de soro (doravante referido como médio) à temperatura ambiente e pique-o em pequenos pedaços (~1 - 2 mm²) usando um bisturi estéril.
5. Transfira tudo (fragmentos de tecido + médio) para um tubo dissociador mecânico C.
6. Enxágüe a placa de Petri e o bisturi com 2 ml de meio usando uma pipeta Pasteur e adicione-a ao tubo C (volume de meio para dissociação = 3 ml).
7. Use o programa dissociador mecânico A.01 para tubos C (o programa mais suave) para homogeneizar os fragmentos de tecido em uma única suspensão celular. Coloque o tubo C no aparelho e execute o programa duas vezes em sucessão (um ciclo = 25 segundos).
   NOTA: Este procedimento de homogeneização foi estabelecido e validado para tecido mamário humano, outros tipos de tumor ou tecido podem precisar usar um programa diferente e devem ser testados primeiro.
8. Remova o tubo C do aparelho e decante o homogeneizar diretamente em um coador de células de 40 μm sentado em um tubo de 50 ml. Usando a mesma pipeta Pasteur da etapa 1.6,transfira qualquer líquido restante no tubo C para o coador de células.
9. Transfira o líquido filtrado para um tubo de 15 ml usando uma ponta de micropipette de 1 ml. Mantenha temporariamente o coador de células e seu tubo de 50 ml.
10. Enxágüe o tubo C com um adicional de 3 ml de meio e transfira-o, novamente usando a mesma pipeta Pasteur da etapa 1.6, para o coador de células ainda sentado no tubo de 50 ml. Esprema uma quantidade máxima do líquido residual preso no tecido nãohomogenizado no tubo de 50 ml movendo-o suavemente ao redor do coador com uma pipeta Pasteur limpa ou uma ponta de 1 ml que é posteriormente jogada fora para evitar contaminar o elunato.
11. Coloque o coador de célula de cabeça para baixo no tubo C original e enxágue com 3 ml de meio para que o tecido não modernizado caia de volta no tubo C.
12. Re homogeneizar como na etapa 1.7 para dois ciclos do programa A.01.
13. Despeje este segundo homogeneizar através do coador de células sentado no tubo de 50 ml, enxaguar o tubo C novamente com 3 ml de meio (como na etapa 1.10) e transferir com a pipeta Pasteur para o coador celular sentado no tubo de 50 ml novamente apertando uma quantidade máxima de líquido do tecido conjuntivo residual preso no coador celular.
14. Neste ponto, um volume de ~2,5 ml está no tubo de 15 ml e ~9 ml no tubo de 50 ml.

2. Separação do Supernante tecidual e células

1. Centrifugar os homogeneiza nos tubos de 15 ml e 50 ml por 15 min a 600 x g em temperatura ambiente.
2. Decante o SN do tubo de 15 ml em um tubo limpo e armazene temporariamente a 4 °C. Este supernasal = tumor primário, NANT ou tecido normal SN (volume final de 2,5 ml) é posteriormente esclarecido e aliquoted antes do armazenamento a -80 °C para análises futuras (veja abaixo).
3. Descarte o supernatante do tubo de 50 ml.
4. Levemente resuspenque ambas as pelotas de célula em um volume final de 1 ml médio. Brevemente, primeiro quebre suavemente a pelota da célula em ambos os tubos (tocando o tubo em uma superfície dura). Resuspenda a pelota de célula solta nos 50 ml com 500 μl de médio e transfira esta suspensão celular para o tubo de 15 ml para resuspensar a segunda pelota. Repita esta etapa uma vez com os 500 μl de médio para recuperação máxima das células.
5. Transfira 10 μl da suspensão celular para um tubo pequeno, misture com 10 μl de azul tripano (diluição 1:1) e conte o número de células viáveis usando um hemócito.
   NOTA: Neste ponto, uma fração da suspensão celular também pode ser analisada por citometria de fluxo para avaliar o tamanho da célula, a granularidade e se desejar um número limitado de marcadores de subpopulação para uma avaliação mais precisa da distribuição celular relativa no homogeneado antes de extensa análise ou experimentação. Todas as análises por citometria de fluxo incorporam rotulagem CD45 para normalização de subpopulações.
6. Pelota as células por centrifugação a 300 x g por 10 minutos à temperatura ambiente. As células do tumor, NANT ou tecido normal estão agora prontas para uma purificação ou análise mais aprofundada. Essas etapas adicionais são melhores quando realizadas no mesmo dia da cirurgia.
   NOTA: Para análise citométrica de fluxo, mas não a triagem celular dos glóbulos vermelhos residuais deve ser líspira após a rotulagem de anticorpos adicionando 0,4 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos à pelota de células, imediatamente vórtices por 1 segundo e incubando um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente (protegido da luz) antes da análise.

3. Esclarecimento do Supernatante tecidual

1. Centrifugar os tubos de 1,5 ml com tecido SN a 15.000 x g por 15 min a 4 °C.
2. Remova cuidadosamente o supernatante sem tocar ou perturbar a pelota. Transfira para um tubo limpo (ou tubos) dependendo do número e volume de alíquotas desejadas.
3. Armazene o supernatante a -80 °C para uso futuro.

Representative Results

Figura 1: Fluxograma de protocolo. Nosso procedimento para o processamento de tecidos humanos frescos e algumas abordagens analíticas que podem ser posteriormente usadas para avaliar linfócitos infiltrados em tecidos humanos são mostrados.

Figura 2: Imagem manchada de H&E de uma impressão de tecido tumoral de mama. Esta marca, retirada de um fragmento de tecido tumoral fresco da mama, mostra a presença de células tumorais com os espaços abertos refletindo áreas que não foram transferidas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain