सॉफ्ट एगर कॉलोनी गठन परख: कैंसर सेल प्रसार पर उपन्यास यौगिकों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो एक नरम आगर कॉलोनी गठन परख का वर्णन करने के लिए एक पैडी एंजाइम अवरोधक और बीबी-सीएल-अमीसिन के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए स्तन कैंसर ट्यूमरजनितता इन विट्रो पर। यह परख आनुवंशिक क्षोभ के संदर्भ में कोशिका परिवर्तन क्षमता के मात्रात्मक मूल्यांकन को भी सक्षम बनाती है।

Protocol

1. 3% की तैयारी 2-हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे

1. एक साफ, सूखी 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में, 2-हाइड्रोक्सीथिल एगर उठे (एगर उठे VII) के 0.9 ग्राम जोड़ें और इसके बाद 30 मिलीलीटर आसुत पानी।
2. 15 सेकंड के लिए मिश्रण माइक्रोवेव और धीरे भंवर। इस चरण को कम से कम तीन बार दोहराएं जब तक कि एगर उठे पाउडर पूरी तरह से घुल न जाए।
3. 15 मिनट के लिए समाधान युक्त बोतल को ऑटोक्लेव करें।
4. आगे के उपयोग से पहले आर टी को ठंडा करने के लिए agarose समाधान की अनुमति दें। समाधान को आरटी पर स्टोर करें।

2. नीचे परत की तैयारी: 0.6% एगर उठे जेल

1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कई 5 मिलीलीटर और 10 मिलीलीटर पिपेट को प्री-वार्म करें ताकि एगर को हैंडलिंग करते समय पिपेट में जमने से रोका जा सके।
2. आंशिक रूप से बोतल ढक्कन ढीला और माइक्रोवेव पूर्व निर्मित 3% 2-हाइड्रोक्सीथिल 15 सेकंड के लिए समाधान उत्पन्न । फिर, धीरे से एक और 15 सेकंड के लिए समाधान और माइक्रोवेव भंवर ।
   सावधानी: एगर उठे समाधान को घूमता समय सावधान रहें क्योंकि हवा के संपर्क में आने पर समाधान बढ़ जाता है और फैल सकता है।
3. यदि बोतल में अवशिष्ट ठोस जेल है, तो कुछ और सेकंड के लिए माइक्रोवेव।
4. अगले चरणों के दौरान एगर उठे समाधान को 45 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में युक्त बोतल रखें ताकि एगर उठे समाधान को समय से पहले जमने से रोका जा सके।
5. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गर्म MCF10DCIS मीडिया।
   नोट: MCF10DCIS मीडिया DMEM/F12, 5% घोड़ा सीरम, 5% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के होते हैं ।
6. 3% एगर उठे समाधान के 3 मिलीलीटर को बाँझ 50 मिलीलीटर शंकु नली में पूर्व-गर्म पिपेट का उपयोग करके स्थानांतरित करें।
7. तुरंत गर्म MCF10DCIS मीडिया के 12 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से शंकु ट्यूब उलटा करने के लिए मीडिया के साथ agarose मिश्रण । किसी भी बुलबुले बनाने की कोशिश न करें क्योंकि यह बाद में कॉलोनी की गिनती में हस्तक्षेप करेगा।
8. धीरे-धीरे किसी भी हवा बुलबुले बनाने के बिना एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
9. मिश्रण को जमना करने की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज रूप से 6-अच्छी संस्कृति प्लेट को इनक्यूबेट करें।
10. मिश्रण जम जाने के बाद, प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। नीचे की परत अब उपयोग के लिए तैयार है।

3. सेल युक्त परत की तैयारी: 0.3% एगर उठे जेल

1. MCF10DCIS कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और उन्हें 4 x 10⁴ /मिलीलीटर की कोशिका एकाग्रता में पतला करें।
2. पूर्व-गर्म पिपेट का उपयोग करके 3% एगर उठे के 2 मिलीलीटर लें और बाँझ 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें।
3. तुरंत शंकु नली के लिए MCF10DCIS मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से मीडिया के साथ agarose मिश्रण करने के लिए उलटा । किसी भी बुलबुले बनाने से बचें।
4. MCF10DCIS कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर ले लो (4 x 10⁴ /मिलीलीटर) और BB-सीएलए (0 μM (DMSO) या 1 μM के साथ इलाज।
5. 1:1 कमजोर पड़ने में, कोशिकाओं को 0.6% एगरे के साथ मिलाएं।
6. सेल-एगर उठे मिश्रण का 1 मिलीलीटर लें और धीरे-धीरे 6-अच्छी संस्कृति प्लेट (2 x 10⁴ कोशिकाओं/मिलीलीटर) की निचली परत पर जोड़ें।
7. शीर्ष परत को जमना करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज रूप से 6-अच्छी संस्कृति प्लेट रखें।
8. मिश्रण जम जाने के बाद, प्लेट को फीडिंग लेयर जोड़ने से पहले एक सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

4. फीडर लेयर की तैयारी: 0.3% एगर उठे जेल

1. माइक्रोवेव पूर्व निर्मित 3% 2-हाइड्रोक्सीथिल 15 सेकंड के लिए समाधान उत्पन्न करें। धीरे-धीरे समाधान और माइक्रोवेव को एक और 15 सेकंड के लिए घूमता है।
2. 45 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एगर उठे समाधान की बोतल को बराबर करें।
3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में MCF10DCIS मीडिया गर्म करें।
4. 9 मिलीलीटर गर्म MCF10DCIS मीडिया के साथ 1 मिलीलीटर का घोल 50 मिलीलीटर शंकु नली में मिलाएं और धीरे-धीरे मीडिया के साथ एगर उठे मिश्रण करने के लिए उलटा करें। हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
5. मिश्रण को बीबी-सीएलए (0 माइक्रोन (डीएमएसओ) या 1 माइक्रोन के साथ इलाज करें।
6. धीरे-धीरे 6-अच्छी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण (बुलबुले बनाने के बिना) में 1 मिलीलीटर जोड़ें जिसमें नीचे और नरम परतें होती हैं।
7. मिश्रण को जमना करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज रूप से 6-अच्छी संस्कृति प्लेट रखें।
8. फीडर लेयर जम जाने के बाद प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
9. कॉलोनी गठन होने तक नए मीडिया के साथ कोशिकाओं की भरपाई करने के लिए मौजूदा फीडर लेयर पर 0.3% agarose/मध्यम/उपचार समाधान के 1 मिलीलीटर ओवरले करके साप्ताहिक रूप से इस भोजन प्रक्रिया को दोहराएं।
   नोट: नरम और फीडर परतों में आगर बहुत नरम है और इसलिए, फीडर परत से जोड़ा पोषक तत्व कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए सेल युक्त परत में आसानी से फैलाना होगा।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1