Soft Agar Colony Formation Assay: Eine Methode, um Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen zu testen

Overview

Dieses Video beschreibt einen Test zur Bildung von Weichagarkolonien, um die Wirkung eines PADI-Enzyminhibitors und BB-Cl-Amidins auf Brustkrebs-Tumorigenität in vitrozu testen. Dieser Test ermöglicht auch die quantitative Bewertung des Zelltransformationspotenzials im Kontext genetischer Störungen.

Protocol

1. Zubereitung von 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose

1. In eine saubere, trockene 100 ml Glasflasche 0,9 g 2-Hydroxyethyl-Agarose (Agarose VII) gefolgt von 30 ml destilliertem Wasser geben.
2. Mikrowelle die Mischung für 15 Sec und sanft wirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens drei weitere Male, bis sich das Agarosepulver vollständig auflöst.
3. Autoclavdie die lösungshaltige Flasche für 15 min.
4. Lassen Sie die Agarose-Lösung vor der weiteren Anwendung auf RT abkühlen. Bewahren Sie die Lösung bei RT auf.

2. Vorbereitung der bodenbelagigen Schicht: 0,6% Agarose Gel

1. Vorerwärmen mehrere 5 ml und 10 ml Pipetten in einem 37 °C Inkubator, um zu verhindern, dass sich die Agarose bei der Handhabung in der Pipette erstarrt.
2. Den Flaschendeckel und die Mikrowelle die vorgefertigte 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung 15 Sek. teilweise lösen. Dann, sanft wirbeln Die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 Sek.
   ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Agarose-Lösung wirbeln, da die Lösung aufsteigt, wenn sie Luft ausgesetzt ist und überschwappen kann.
3. Wenn es Rest-Festgel in der Flasche, Mikrowelle für ein paar weitere Sekunden.
4. Bewahren Sie die Flasche mit der Agaroselösung in einem 45 °C-Wasserbad bei den nächsten Schritten auf, um eine vorzeitige Erstarrung der Agaroselösung zu verhindern.
5. Warmes MCF10DCIS-Medium in einem 37 °C-Wasserbad.
   HINWEIS: MCF10DCIS Medien besteht aus DMEM/F12, 5% Pferdeserum, 5% Penicillin-Streptomycin.
6. 3 ml der 3% Agaroselösung mit den vorgewärmten Pipetten in ein steriles 50 ml konisches Rohr geben.
7. Fügen Sie sofort 12 ml warme MCF10DCIS-Medien hinzu und invertieren Sie das konische Rohr vorsichtig, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Versuchen Sie nicht, irgendwelche Blasen zu bilden, da es mit der Kolonie Zählen später stören wird.
8. Fügen Sie 2 ml dieser Mischung vorsichtig in jeden Brunnen einer 6-Well-Kulturplatte ein, ohne Luftblasen zu bilden.
9. Inkubieren Sie die 6-Well-Kulturplatte horizontal auf einer ebenen Oberfläche bei 4 °C für 1 Stunde, damit sich die Mischung erstarren lässt.
10. Nach der Erstarrung der Mischung die Platte 30 min in einen 37 °C-Inkubator geben. Die untere Ebene ist nun einsatzbereit.

3. Zubereitung der zellhaltigen Schicht: 0,3% Agarose Gel

1. Versuchen Sie MCF10DCIS-Zellen und verdünnen Sie sie auf eine Zellkonzentration von 4 x 10⁴ /ml.
2. Nehmen Sie 2 ml der 3% Agarose mit vorgewärmten Pipetten und geben Sie es in ein steriles 50 ml konisches Rohr.
3. 8 ml MCF10DCIS-Medien sofort in das konische Rohr geben und vorsichtig invertieren, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie es, Blasen zu bilden.
4. Nehmen Sie 2 ml der MCF10DCIS-Zellen (4 x 10⁴ /ml) und behandeln Sie sie mit BB-CLA (0 M (DMSO) oder 1 m).
5. In einer 1:1-Verdünnung die Zellen mit der 0,6% Agarose vermischen.
6. Nehmen Sie 1 ml der Zell-Agarose-Mischung und fügen Sie vorsichtig auf die untere Schicht der 6-Well-Kulturplatte (2 x 10⁴ Zellen/ml).
7. Legen Sie die 6-Well-Kulturplatte für mindestens 15 min horizontal auf eine flache Oberfläche bei 4 °C, damit sich die obere Schicht festigen kann.
8. Nachdem sich die Mischung verfestigt hat, legen Sie die Platte eine Woche lang in einen 37 °C-Inkubator, bevor Sie die Zuführschicht hinzufügen.

4. Vorbereitung der Feederschicht: 0,3% Agarose Gel

1. Mikrowelle die vorgefertigte 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung für 15 Sek. sanft wirbeln die Lösung und Mikrowelle für weitere 15 Sec.
2. Die Agarose-Lösungsflasche in einem 45 °C-Wasserbad ausdemieren.
3. Erwärmen Sie die MCF10DCIS-Medien in einem 37 °C-Wasserbad.
4. 1 ml 3% Agaroselösung mit 9 ml warmen MCF10DCIS-Medien in ein 50 ml konisches Rohr mischen und vorsichtig invertieren, um die Agarose mit den Medien zu mischen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
5. Behandeln Sie die Mischung mit BB-CLA (0 M (DMSO) oder 1 M).
6. Fügen Sie 1 ml dieser Mischung (ohne Blasenbildung) vorsichtig in jeden Brunnen der 6-Well-Kulturplatte, die die unteren und weichen Schichten enthält.
7. Legen Sie die 6-Well-Kulturplatte für mindestens 15 min horizontal auf eine flache Oberfläche bei 4 °C, damit sich die Mischung erstarren lässt.
8. Nachdem sich die Zufessschicht verfestigt hat, legen Sie die Platte in einen 37 °C-Inkubator.
9. Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, indem Sie 1 ml 0,3% Agarose/Medium/Behandlungslösung auf die vorhandene Feederschicht überlagern, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet wird.
   HINWEIS: Agar in den weichen und Feeder-Schichten ist sehr weich und daher werden die zugesetzten Nährstoffe aus der Feederschicht leicht in die zellhaltige Schicht diffundieren, um die Zellen zu erreichen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1