סופט אגר היווצרות המושבה Assay: שיטה כדי לבדוק את ההשפעות של תרכובות הרומן על התפשטות תאים סרטניים

Overview

וידאו זה מתאר אגר רך היווצרות מושבה assay כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים PADI ו BB-Cl-amidine על גידולים סרטן השד במבחנה. בדיקה זו מאפשרת גם הערכה כמותית של פוטנציאל טרנספורמציה של תאים בהקשר של הפרעות גנטיות.

Protocol

1. הכנת 3% 2-הידרוקסיאתיל אגרוז

1. לתוך בקבוק זכוכית נקי ויבש 100 מ"ל, להוסיף 0.9 גרם של 2-hydroxyethyl agarose (Agarose השביעי) ואחריו 30 מ"ל של מים מזוקקים.
2. יש לחמם במיקרוגל את התערובת למשך 15 שניות ולהסתחרר בעדינות. חזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים נוספות עד אבקת agarose מתמוסס לחלוטין.
3. מובלעת אוטומטית את הבקבוק המכיל את הפתרון במשך 15 דקות.
4. אפשר לפתרון agarose להתקרר ל- RT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון ב- RT.

2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% ג'ל אגרוז

1. מחממים מראש כמה 5 מ"ל ו 10 מיליליטר פיפטות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע את agarose מלהתגבש פיפטה בעת הטיפול.
2. שחררו חלקית את מכסה הבקבוק ומיקרוגל את תמיסת 3% 2-hydroxyethyl agarose המיוצרת מראש למשך 15 שניות. לאחר מכן, בעדינות מערבולת הפתרון ומיקרוגל עוד 15 שניות.
   אזהרה: היזהר בעת מערבולת פתרון agarose כי הפתרון עולה כאשר נחשף לאוויר יכול לשפוך מעל.
3. אם יש שאריות ג'ל מוצק בבקבוק, מיקרוגל עוד כמה שניות.
4. שמור את הבקבוק המכיל את הפתרון agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס במהלך השלבים הבאים כדי למנוע את פתרון agarose מלהתמצק בטרם עת.
5. מדיה חמה MCF10DCIS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   שים לב: MCF10DCIS מדיה מורכבת DMEM / F12, 5% סרום סוס, 5% סטרפטומיצין פניצילין.
6. העבר 3 מ"ל של תמיסת 3% agarose באמצעות פיפטות מחוממת מראש לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל חרוט.
7. מיד להוסיף 12 מ"ל של מדיה חמה MCF10DCIS בעדינות להפוך את הצינור חרוט לערבב את agarose עם התקשורת. נסה לא ליצור בועות כפי שהוא יפריע המושבה לספור מאוחר יותר.
8. מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של תערובת זו לכל באר של צלחת תרבות 6-באר מבלי ליצור בועות אוויר.
9. דגירה צלחת תרבות 6-גם אופקית על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה כדי לאפשר את התערובת להתמצק.
10. לאחר התערובת מתגבשת, מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. השכבה התחתונה מוכנה כעת לשימוש.

3. הכנת שכבה המכילה תאים: 0.3% ג'ל אגרוז

1. טריפסינייז MCF10DCIS תאים לדלל אותם לריכוז התא של 4 x 10⁴ /ml.
2. קח 2 מ"ל של 3% agarose באמצעות פיפטות מחוממים מראש ולהעביר לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל חרוט.
3. מיד להוסיף 8 מ"ל של מדיה MCF10DCIS לצינור חרוט בעדינות להפוך לערבב את agarose עם התקשורת. הימנע מיצירת בועות.
4. קח 2 מ"ל של תאי MCF10DCIS (4 x 10⁴ /ml) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
5. בדילול 1:1, מערבבים את התאים עם 0.6% agarose.
6. קח 1 מ"ל של תערובת התא-agarose בעדינות להוסיף על השכבה התחתונה של צלחת תרבות 6-well (2 x 10⁴ תאים / מיליליטר).
7. מניחים את צלחת התרבות 6-well אופקית על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות כדי לאפשר את השכבה העליונה להתמצק.
8. לאחר התערובת מתגבשת, מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפני הוספת שכבת ההאכלה.

4. הכנת שכבת המאכיל: 0.3% ג'ל אגרוז

1. מחממים במיקרוגל את תמיסת 2-Hydroxyethyl agarose המיוצרת מראש למשך 15 שניות.
2. משווים את בקבוק התמיסה agarose באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
3. לחמם את המדיה MCF10DCIS באמבט מים 37 °C (60 °F).
4. מערבבים 1 מ"ל של 3% פתרון agarose עם 9 מ"ל של מדיה MCF10DCIS חם לתוך צינור חרוט 50 מ"ל בעדינות להפוך לערבב את agarose עם התקשורת. הימנע מיצירת בועות אוויר.
5. פנקו את התערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
6. מוסיפים בעדינות 1 מ"ל של תערובת זו (מבלי ליצור בועות) לתוך כל באר של צלחת תרבות 6 באר המכילה את השכבות התחתונות והרכות.
7. מניחים את צלחת התרבות 6-well אופקית על משטח שטוח ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות כדי לאפשר את התערובת להתמצק.
8. לאחר שכבת ההזנה מתגבשת, מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
9. חזור על הליך האכלה זה מדי שבוע על ידי כיסוי 1 מ"ל של 0.3% agarose / פתרון בינוני / טיפול על שכבת ההזנה הקיימת כדי לחדש את התאים עם מדיה חדשה עד היווצרות המושבה נצפתה.
   שים לב: אגר בשכבות הרכות והמאכילות רך מאוד, ולכן החומרים המזינים הנוספים משכבה ההזנה יתפזרו בקלות לשכבה המכילה תאים כדי להגיע לתאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1