軟寒天コロニー形成アッセイ:癌細胞増殖に対する新規化合物の効果を試験する方法

Overview

このビデオでは、PADI酵素阻害剤およびBB-Cl-アミドインが乳がん腫瘍原性に及ぼす影響を試験するための軟寒天コロニー形成アッセイ について説明する。このアッセイは、遺伝的摂動の文脈における細胞変換ポテンシャルの定量的評価も可能にする。

Protocol

1. 3%2-ヒドロキジエチルアガロースの調製

1. 清潔で乾燥した100mlガラス瓶に0.9gの2-ヒドロキイェチルアガロース(アガロースVII)を加え、続いて30mlの蒸留水を加えます。
2. 混合物を15秒間電子レンジで回し、そっと渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、このステップを少なくとも3回繰り返します。
3. 15分間、溶液含有ボトルをオートクレーブします。
4. アガロース溶液をRTに冷却してからさらに使用してください。ソリューションを RT に保存します。

2. ボトム層の調製: 0.6% アガロースゲル

1. 取り扱い時にアガロースがピペット中で固化するのを防ぐために、37°Cインキュベーターで数5mlと10mlのピペットを予熱します。
2. ボトル蓋を部分的に緩め、あらかじめ作られた3%の2-ヒドロキイェチルアガロース溶液を15秒間緩めます。その後、溶液と電子レンジを15秒間静かに旋回します。
   注意: アガロース溶液を渦巻くときは、空気に曝露すると溶液が立ち上がり、こぼれ落ちる可能性があるため、注意してください。
3. ボトルに残留固形ゲルがある場合は、電子レンジをさらに数秒間使用する。
4. アガロース溶液が早期に固まりないように、次のステップで45°Cの水浴中にアガロース溶液を含むボトルを保管してください。
5. 37 °Cの水浴でMCF10DCISメディアを温めます。
   注: MCF10DCIS培地は、DMEM/F12、5%馬血清、5%ペニシリンストレプトマイシンから構成されています。
6. 3%アガロース溶液の3mlを、あらかじめ温めたピペットを使用して滅菌50ml円錐管に移す。
7. すぐに12mlの暖かいMCF10DCIS培地を加え、円錐管を穏やかに反転してアガロースをメディアと混合する。それは後でカウントコロニーを妨げるので、任意の気泡を形成しないようにしてください。
8. 気泡を形成することなく、6ウェル培養プレートの各ウェルにこの混合物の2mlをそっと加えます。
9. 6ウェル培養プレートを4°Cの平らな表面に水平に1時間インキュベートし、混合物を固化させます。
10. 混合物を固めた後、30分間37°Cインキュベーターにプレートを入れます。下層を使用する準備ができました。

3. 細胞含有層の調製:0.3%アガロースゲル

1. MCF10DCIS細胞をトリプシン化し、4 x 10⁴ /mlの細胞濃度に希釈する。
2. 事前に温めたピペットを使用して3%アガロースの2mlを取り、滅菌50ml円錐管に移します。
3. 直ちにMCF10DCIS培地を円錐管に加え、静かに反転してアガロースをメディアと混合します。気泡を形成しないでください。
4. MCF10DCIS細胞(4 x 10⁴ /ml)を2ml取り、BB-CLA(0 μM(DMSO)または1μMで処理します。
5. 1:1希釈で、0.6%のアガロースと細胞を混合する。
6. 細胞アガロース混合物の1mlを取り、穏やかに6ウェル培養プレート(2 x 10⁴細胞/ml)の底層に加えます。
7. 6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に置き、上層を固化させます。
8. 混合物を固めた後、給餌層を加える前に1週間、プレートを37°Cインキュベーターに入れます。

4. フィーダー層の調製: 0.3% アガロースゲル

1. あらかじめ作られた3%の2-Hydroxyethylアガロース溶液を15秒間マイクロ波にし、溶液を穏やかに旋回し、マイクロ波をさらに15秒間旋回させる。
2. 45°Cの水浴でアガロース溶液ボトルを平衡化します。
3. MCF10DCISメディアを37°Cの水浴で温めます。
4. 3%アガロース溶液1mlを9mlの暖かいMCF10DCIS培地と50mlの円錐チューブに混ぜ、穏やかに反転してアガロースを培地と混合します。気泡を形成しないでください。
5. BB-CLA(0 μM(DMSO)または1 μMで混合液を処理します。
6. 底と柔らかい層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに、この混合物の1ml(泡を形成せずに)を穏やかに加えます。
7. 6ウェル培養プレートを4°Cの平らな表面に水平に置き、少なくとも15分間置き、混合物を固化させます。
8. フィーダー層を固めた後、プレートを37°Cインキュベーターに入れます。
9. コロニー形成が観察されるまで、1mlの0.3%アガロース/ミディアム/処理溶液を既存のフィーダー層に重ね、細胞に新しい培地を補充することで、この摂食手順を毎週繰り返します。
   注: 柔らかいおよびフィーダー層の寒天は非常に柔らかく、従って、フィーダー層から加えた栄養素は細胞を含む層に容易に拡散して細胞に到達する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1