부드러운 천식대 형성 분석: 암 세포 증식에 새로운 화합물의 효과 테스트 하는 방법

Overview

본 비디오는 시험관내유방암 종양유발성에 대한 PADI 효소 억제제 및 BB-Cl-amidine의 효과를 테스트하기 위한 부드러운 한천 식민지 형성 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 또한 유전 적 동요의 맥락 내에서 세포 변환 잠재력의 정량적 평가를 가능하게합니다.

Protocol

1. 3 % 2-하이드록세틸 아가로즈의 준비

1. 깨끗하고 건조한 100ml 유리 병에 넣고 2-하이드록세틸 아가로즈(아가로즈 VII)를 0.9g, 증류수 30ml를 넣습니다.
2. 혼합물을 15초 동안 전자레인지에 넣고 부드럽게 소용돌이시다. 아가로즈 파우더가 완전히 녹을 때까지 이 단계를 적어도 세 번 이상 반복하십시오.
3. 15분 동안 용액 함유 병을 자동 복제합니다.
4. 아가로즈 용액을 추가 사용 전에 RT로 냉각할 수 있도록 허용합니다. 솔루션을 RT에 저장합니다.

2. 하단 층의 준비 : 0.6 % 아가로즈 젤

1. 처리 시 아가로즈가 파이펫에 응고되는 것을 방지하기 위해 37°C 인큐베이터에서 5ml 및 10ml 파이펫을 미리 데우고 있습니다.
2. 병 뚜껑을 부분적으로 풀고 15초 동안 미리 만들어진 3% 2-하이드록시틸 아가로즈 용액을 전자레인지에 담급니다. 그런 다음 용액을 부드럽게 소용돌이시키고 전자 레인지를 15 초 간 추가로 돌이릅니다.
   주의: 공기에 노출되면 용액이 상승하고 유출 될 수 있기 때문에 아가로즈 용액을 소용돌이 시주의하십시오.
3. 병에 잔류 솔리드 젤이 있으면 몇 초 더 전자 레인지에 전자 레인지.
4. 아가로즈 용액이 조기에 고화되는 것을 방지하기 위해 다음 단계 동안 45°C 수조에 아가로즈 용액을 함유한 병을 보관하십시오.
5. 따뜻한 MCF10DCIS 미디어37°C 수조.
   참고: MCF10DCIS 미디어는 DMEM/F12, 5% 말 혈청, 5% 페니실린 연쇄상 구균으로 구성되어 있습니다.
6. 미리 데운 파이펫을 사용하여 3% 아가로즈 용액 3ml를 멸균 50ml 원문 튜브로 옮기습니다.
7. 즉시 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 12ml를 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로즈를 혼합하기 위해 원추형 튜브를 반전. 나중에 식민지 계산을 방해할 수 있으므로 거품을 형성하지 마십시오.
8. 기포를 형성하지 않고 6웰 배양 판의 각 웰에 이 혼합물 2 ml를 부드럽게 넣습니다.
9. 혼합물이 고화될 수 있도록 4°C에서 평평한 표면에 수평으로 6웰 배양판을 배양한다.
10. 혼합물이 고화된 후 플레이트를 37°C 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 이제 하단 레이어를 사용할 준비가 되었습니다.

3. 세포 함유 층의 준비: 0.3% 아가로즈 젤

1. 트립시니게스맥F10DCIS 세포를 4 x 10^4/ml의 세포 농도로 희석시합니다.
2. 미리 데워진 파이펫을 사용하여 3% 아가로즈 2ml를 복용하여 멸균 50ml 원문 튜브로 옮겨넣습니다.
3. 즉시 MCF10DCIS 미디어 8ml를 원추형 튜브에 넣고 아가로즈를 미디어와 혼합하기 위해 부드럽게 반전합니다. 거품을 형성하지 마십시오.
4. MCF10DCIS 셀 2ml(4 x 10 4/ml)를 복용하고 BB-CLA(0 μM(DMSO) 또는 1μM로 치료하십시오.
5. 1:1 희석에서 세포를 0.6% 아가로즈와 섞는다.
6. 세포 아가로즈 혼합물 1 ml를 복용하고 6웰 배양 판(2 x 10⁴ 셀/ml)의 바닥 층에 부드럽게 넣습니다.
7. 6웰 배양판을 평평한 표면에 4°C에서 4°C로 수평으로 배치하여 상단 층이 고화되도록 합니다.
8. 혼합물이 고화된 후, 공급 층을 추가하기 전에 1 주일 동안 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣습니다.

4. 피더 층의 준비 : 0.3 % 아가로즈 젤

1. 미리 만들어진 3% 2-하이드록세틸 아가로즈 용액을 15초 간 전자레인지에 부드럽게 돌리면 용액과 전자레인지를 15초 간 부드럽게 돌릴 수 있습니다.
2. 45°C 수조에서 아가로즈 용액 병을 평형화합니다.
3. 37°C 수조에서 MCF10DCIS 미디어를 따뜻하게 합니다.
4. 따뜻한 MCF10DCIS 미디어 9ml와 아가로즈 용액 1ml를 50ml 원추형 튜브에 넣고 아가로즈를 미디어와 혼합합니다. 기포를 형성하지 마십시오.
5. 혼합물을 BB-CLA(0 μM(DMSO) 또는 1μM로 처리합니다.
6. 바닥과 부드러운 층을 포함하는 6 웰 배양 판의 각 우물에 이 혼합물 1 ml (거품을 형성하지 않고)를 부드럽게 넣습니다.
7. 6웰 배양판을 평평한 표면에 4°C에서 4°C로 수평으로 배치하여 혼합물이 고화되도록 합니다.
8. 피더 층이 고화되면 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
9. 식민지 형성이 관찰될 때까지 세포를 새로운 배지로 보충하기 위해 기존 피더 층에 0.3% 아가로즈/중간/치료 용액1 ml를 오버레이하여 매주 이 급식 절차를 반복한다.
   참고: 연약하고 피더 층의 한천은 매우 부드러므로 피더 층의 추가 된 영양소가 세포 함유 층으로 쉽게 확산되어 세포에 도달합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1