Overview
Denne video beskriver en teknik til at forberede brystkræft celleprøver til metabolit profilering. Brystkræftceller behandles med østradiol, som binder sig til østrogenreceptoren alpha og forårsager ændringer i metabolittens sammensætning.
Protocol
1. Metabolomics Assay Prøve Forberedelse
- Cellekultur og -behandling
- Frø 400.000 MCF7 celler pr 10 cm plade i vækstmedium. Til hver behandling forberedes tre prøver. Brug to plader i hver prøve til at modtage nok celler til detektionen. På dag 3 fjernes mediet og tilsættes 5 ml frisk medium med eller uden 10-8 M Østradiol eller E2 til cellerne. Cellerne behandles i 24 timer (37 °C i befugtet 5% CO2-atmosfære).
- Eksempel på indsamling
- Der tilsættes 5 ml iskold 1x PBS til pladen, PBS efter kort at have vippet pladen flere gange. Gentag to gange, og fjern så meget PBS som muligt efter den sidste vask.
- Der tilsættes 750 μl forkold acetone til hver plade, og cellerne skrabes. Kombiner cellerne i acetone fra to plader i et 2 ml rør på is.
- Antal celler til normalisering
- Til hver behandling skal du bruge to ekstra plader til cellekvantificering. Cellerne fra pladen skal sættes af, tilsættes 2 ml HE-buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO3 og 1 mM EDTA) i hver plade og inkuberes i 5 min.
- Indsaml og bland cellerne godt ved at pipettere celler i HE-bufferen. Brug i alt 20 μl celleopløsning til at tælle cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
- Prøverne opbevares ved -80 °C, før de sendes til Metabolomics-centret for at identificere og kvantificere metabolitterne ved hjælp af gaskromatografimassespektrometrianalyse (GC-MS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.