Summary
Kayma akışı içinde derme çatma bir besin bir deniz manzarası ve yüzme davranışı içinde bakteri deniz mikropların kemotaktik toplayıcı davranış eğitimi için mikroakışkan kanalları ve deneylerde bunların uygulanmasını imalat açıklanmıştır.
Abstract
Microscale kaynak yamalar yararlanmak için planktonik mikropların derecesi okyanus trophodynamics ve biyojeokimyasal akı önemli etkileri olacaktır. Ancak, yüzme mikropların yamalar kullanılabilirliği ve onları bulmak için bakteri yeteneğini sınırlayabilir moleküler difüzyon ve türbülanslı kayma da dahil olmak üzere fiziksel güçlerin etkilerini aşmak gerekir, okyanus besin yamalar yararlanmak için. Yakın zamana kadar, metodolojik sınırlamalar yamalı habitatlar ve gerçekçi küçük ölçekli akış koşulları içinde mikrobiyal davranışı doğrudan muayene engellemiştir. Bu nedenle, teorik tahminlerin çok okyanus mikrobiyal davranışı ile ilgili mevcut bilgi temin edilmiştir. 2 mikroakışkan oluşturmak için kullanılan cihazlar, (i) okyanus süreçleri ile ilgili boyutları ve Difuzyonun özellikleri ile besin yamaları microscale ve (ii) microscale geliştirmek için yumuşak litografik üretim teknikleri uyguladık okyanus mikrobiyal yiyecek arama davranışı üzerinde yeni bir bilgi elde etmek için okyanusta beklenen karşılık gelen kesme oranları ile vortekslerini. Bu mikroakışkan cihazlar, heterojen ve dinamik bir deniz manzarası içinde mikrobiyal yüzme ve kemotaktik davranış bir ilk doğrudan muayene izin var. Bireysel mikropların yüzme davranışına ek olarak, toplum düzeyinde agregatif yanıt gözlemlerken Epifloresans ve faz kontrast mikroskobu kombine kullanımı, fiziksel boyutları ve besin yamalar uzadıya özellikleri doğrudan muayene izin verir. Bu deneyler, fitoplankton, heterotrof bakteri ve phagotrophic protistler bazı türlerin çok kısa bir zaman çerçevesi içinde difüzyon microscale kaynak yamalar bulma ve istismar usta olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca kesme oranları orta derecede olduğunu göstermiştir, deniz bakteri kendi istekleriyle akışı ve yüzme çevreleri ile mücadele etmek mümkün. Ancak, yüksek kesme bir eşik düzeyinin ötesinde, bakteri kayma akması hizalanmış ve akış bozukluğu olmadan yüzme az yetenekli. Mikroakiskan sucul mikrobiyal ekoloji eğitim için yeni ve ucuz bir yaklaşım temsil eder ve doğru microscale ve yüzey eğimleri gerçekçi akış alanları oluşturmak için uygunluğu nedeniyle ideal etkileşim küçük ölçeklerde mikrobiyal davranış sınavlara uygulanabilir. Bu nedenle Mikroakiskan okyanusta mikroorganizmaların ekolojisi daha iyi bir anlayış elde etmek için değerli bir araç temsil ettiğini düşündürmektedir.
Protocol
Hazırlık
1. Mask oluşturun
Bir CAD yazılımı kullanarak, yüksek çözünürlüklü bir şeffaflık baskı için kanal tasarımı. Bu, "maske" olacaktır.
Temiz oda:
2. Gofret temizleyin ve fırında
İlk, Aseton ile fışkırtma gofret, sonra hızla Metanol ile, daha sonra Isopropanol. Son olarak, gofret Azot kullanarak kurutun.
5 dakika fırında (130 ° C) gofret pişirin.
3. Kaplama gofret
Spin-kaplama makinesi merkezinde gofret yerleştirin. Şişe gofret üzerine dökün fotorezist (SU-8). SU-8 akım edelim ve ~ 10 saniye süreyle dinlenin Spin-lak açın ve 0 ile 5 sn içinde 500 rpm hız rampası, 10 s için 500 rpm'de 10 sn içinde son hıza kadar rampa ve son hızda korumak için 30 saniye Son hızı kullanılan hedeflenen kaplama kalınlığı ve SU-8 bağlıdır. Ayrıntılar bulunabilir http://www.microchem.com/
4. Yumuşak bake
Gofret kaplama sonra, 65 ° C ve daha sonra 95 ilk fırında ° C Pişirme süresi, kullanılan paslanmaz çeliğin hedeflenen kalınlık ve türüne göre değişir. Sonra, gofret, en az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
5. Maruz kalma
Maske gofret üstüne yerleştirin ve SU-8 kılavuzunda önerilen süre için UV ışığı gofret maruz.
6. Post-maruz kalma fırında
Gofret pişirin 65 ° C ve daha sonra 95 ° C SU-8 manuel talimatları izleyerek.
7. Gofret Gelişmekte olan "master" (küf) elde etmek için
Geliştirici (PMMA) ile dolu bir beher hazırlayın. Fotorezist Pozlanmamış parçası yıkanıp kadar çok nazikçe beher salınan behere gofret bırakın.
Laboratuarımızda:
8. PDMS hazırlayın ve gofret üzerine dökün
Bir kap içine 10:1 oranını PDMS sertleştirici ile karıştırın. Karıştırın ve homojen bir karışımı: Bu baloncuklar çok üretmek ve karışımı opak bir görünüm yapacak. "Ana" karışımı dökün.
9 - De-bubble vakum odasına
Kabarcıklarını çıkarmak için, bir vakum odasına kadar tüm kabarcıklar gitti kapsayan master ve PDMS karışımı yerleştirilir.
10 Fırın Pişirme
En az 12 saat, 65 ° C sertleşmesine PDMS fırında pişirin .
11. Delgeç
Kanalların giriş ve çıkışları için ana ve zımba delikleri PDMS soyun.
Temiz (gösterilmemiştir)
12. Plazma bağlar
Kanallar PDMS katman ve 1 dakika boyunca oksijen plazma ile cam slayt hem de tedavi sonrası bir bardak slayt yapıştırılır.
Deneyleri:
Uzm # 1: mikro ölçekli besin katmanları deniz mikropların kemotaktik yanıt incelenmesi
1) deneme ayarlama
- Cam şırınga organizmalar ve substratlar
- Mikroskop sahneye mikroakışkan kanal yerleştirin ve uygun giriş ve çıkışlarının boru eklemek
- Rezervuar atık boru bağlayın. Borular tamamen basınç salınımlarını engellemek için, sıvı atık rezervuar sular altında emin olun.
- Yeri şırınga ve şırınga pompası üzerine vana ve boru bağlantı
- Işık koşullarında, büyütme, vb: mikroskop
- Kanal uygun pozisyonda odaklanın
- De-kabarcık kanal kullanılarak yapay deniz suyu ile doldurulmuş büyük şırınga
- Şırınga pompası uygun akış hızını ayarlayın. Bu durumda kanal 220 mikron s -1 ortalama akış hızı karşılık gelen 2 ml / dk,
2) deney Koşu
- Bir besin degrade kanal kurmak için şırınga pompası Başlat
- Akış stabilize ve besinlerin bir grup geliştirmiştir sonra şırınga pompası akışını durdurmak ve bu noktadan itibaren kayıt süresi başlar
- Besin bant yanal diffüz başlar
- Düzenli zaman aralıklarıyla, çerçeveli dizileri kaydetmek için 'film' oluşturmak için görüntü analiz yazılımı kullanın
- Yüzme organizmalar, sadece hareket eden nesneleri görüntülenebilmekte, böylece, sonraki iki kare arasındaki zaman farkı fotoğraf çekmek bize hareketli olmayan parçacıklar ve arka plan gürültüsü hareketli hücreleri ayırt etmek için izin Ayırım
- P referans kanal hücrelerin pozisyonlarını belirlemek için film çekinbesin yama, osition
- 10-20 dakika süreyle düzenli aralıklarla kayıt filmler pozisyonları ve organizmaların yüzme desen analiz
- Farklı çerçeveler (her bir pikselin o piksel film süresi boyunca kaydedilen maksimum ışık yoğunluğu atama) organizmaların pozisyonlar üst üste görüntü analiz yazılımı kullanarak, yüzme hücreler için yörünge bilgi alabilirsiniz
Uzm # 2: bir vortexZ yüzme deniz bakteriler üzerinde kayma etkileri araştırılması
- Farklı kanal geometrisi kullanarak, bakterilerin farklı kayma hızı oranlarının bir girdap yüzme davranışlarını gözlemleyebilirsiniz
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deniz mikropların kendi yerel kimyasal ve fiziksel çevre ile etkileşim nasıl bir anlayış, okyanusların besin ve karbon döngüsü (Azam ve Malfatti 2007) planktonik mikroorganizma rolü daha tam ve kesin bir algı için zorunludur. Ancak, birçok önemli mikrobiyal etkileşimleri üzerinde küçük ölçeklerde (mm) nedeniyle, teknik sınırlamalar heterojen biyo-fiziko-kimyasal bir manzara içinde mikrobiyal davranışı ayrıntılı muayene engellemiştir okyanus yüzme mikropların yaşadığı tahmin. Mikroakiskan son gelişmeler (Whitesides ve ark 2001), mikrobiyal ekoloji karmaşık microhabitats içinde detaylı analizler etkin (Mao ve ark 2003, Park ve ark 2003, Keymer ve ark 2006, Marcos ve Stocker 2006). Mikroakışkan cihazlar tek bir hücre düzeyinde (Blackburn ve ark 1997, 1998) bize bir difüzyon besin yama deniz mikropların hem kemotaktik yanıt incelemek için izin burada açıklanan ve çalkantılı kesme içinde mikropların yüzme davranışı.
Mikroakışkan kanalları yapımında yer yumuşak litografik üretim süreci, kanallar içinde akar ve degradeleri hassas kontrolüne izin veren kanal mimarisi içinde oluşturulacak karmaşık detayları için sağlar. Karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulan çeşitli ölçüler kanalları için üretim tekniği ile sağladığı esneklik sağlar. Görüntü analiz sistemi, burada tek tek hücrelerin ve besin gradyanlar görselleştirme mikrobiyal yüzme ve kemotaktik davranış ayrıntılı kantitatif analiz için bir platform sağlayan tek hücreli ve nüfus seviyesi, izin uygulanır.
Biz bu mikroakışkan kanal yüzme deniz mikropların çeşitli hassas bir kemotaksis assay olarak uygulanan ve birçok türün yama içinde yüksek besin konsantrasyonu içinde hücre yoğun kümeler oluşturan, hızla bir besin difüzyon yama cevap verme kapasitesine sahip olduğunu bulduk. Kemotaktik besin yama içinde hücreler birikimine sırasında, bazı türler de hız yüzme ve frekans dönüm değişiklikler de dahil olmak üzere davranışsal vardiya, işaretlenir sergiledik. Bizim gözlemler, önemli bir büyüme habitatlar olarak okyanus deniz mikroplar kısa ömürlü besin yamaları kullanabileceği anlamına hipotezini deneysel destek sağlar.
Farklı kanal geometrisi kullanarak, su ortamında mikrobiyal dinamikleri ile ilgili ölçeklerde istikrarlı microvortices üretebilir. Bu kurulum, bize farklı kesme oranları yanıt yüzme bakterilerin davranışlarını gözlemlemek için izin verir. Latent akım koşul altında rasgele yüzme davranışı tersine, güçlü bir kayma etkisi altında, bakteri hem de takip akış alanının düzenler ve onlarla uyumlu. Bu kurulum, mikroorganizmalar ve onların sıvı dinamik çevre arasındaki temel etkileşim değerli bilgiler sunmaktadır.
Bu deneylerin her birinde, Mikroakiskan mikrobiyal davranışı dinamik microhabitats içinde eğitim için etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Mikrobiyal dinamiklerinin doğal habitatları ve mikroakışkan teknolojinin yeni uygulamaları içinde önemi giderek artan bir tanıma, biz mikrobiyal ekoloji ile Mikroakiskan daha kaplin önemli yeni anlayışlar verecektir öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
MIT'de Microsystems Teknoloji Laboratuvarları Biz temiz oda tesisi bu video filmi parçası için bize izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
