Summary
Мы опишем метод неоднократно визуализации мышиной микроглии и циркулирующие моноциты
Abstract
Традиционно в области неврологии, в естественных условиях двухфотонного изображений мышиной центральной нервной системы или связаны с использованием открытого черепа 1,2 или разбавленной-череп 3 препарата. Хотя открытого черепа техника является очень гибким, оно не является оптимальным для изучения микроглии, потому что это инвазивный и может привести к активации микроглии. Хотя в разреженных черепа подход минимально инвазивных, повторяется заново истончение черепа, необходимых для хронических изображений увеличивает риск повреждения тканей и активации микроглии и позволяет ограниченное число изображений сессий. Здесь мы представляем хронических тонкие черепа окна метод мониторинга мышиной микроглии в естественных условиях в течение длительного периода времени с помощью двух-фотонного микроскопа. Мы демонстрируем, как подготовить стабильной, доступной, в разреженных черепа корковых окна (TSCW) с соединенный стекло покровное, что остается полупрозрачной в течение трех недель периодического наблюдения. Этот препарат TSCW гораздо более иммунологически инертен по отношению к активации микроглии, чем открытые краниотомии или повторные черепа прореживания и позволяет произвольным количеством изображений сессий в течение периода времени недель. Мы готовим TSCW в CX 3 CR 1 GFP / + мышей 4 визуализировать микроглии с повышенной зеленый флуоресцентный белок до ≤ 150 мкм под мягкой мозговой оболочки поверхности. Мы также показываем, что этот препарат может быть использован в сочетании с стереотаксической инъекции мозг ВИЧ-1 нейротоксическое белок Tat, прилегающих к TSCW, который способен вызывать прочный microgliosis. Поэтому этот метод является чрезвычайно полезным для изучения изменений в микроглии морфологии и подвижности с течением времени в живой мозг в моделях ВИЧ-ассоциированного Нейрокогнитивная расстройство (РУК) и других нейродегенеративных заболеваний с neuroinflammatory компонента.
Protocol
1. Подготовка животных для работы с изображениями
- В наших экспериментах мы используем взрослых CX 3 CR 1 GFP / + мышей, которые выражают GFP в мононуклеарных клеточных поколений, в том числе микроглии. 4 различных линий мышей могут быть использованы для удовлетворения потребностей конкретного проекта.
- Анестезию мыши при введении препарата в три препарата коктейль, состоящий из 0,05 мг / кг фентанила, 5,0 мг / кг Мидазолам и 0,5 мг / кг Medetomidine 5. Хирургическая подготовка к TSCW начинается после животное больше не реагирует на болевые стимулы, такие, как хвост крайнем случае. На протяжении хирургии и обработки изображений, мы держим животных на грелку, чтобы предотвратить после анестезии гипотермии. Если необходимо, бустерной дозы одной трети оригинального дозу анестетика коктейль может быть дано для восстановления первоначальной плоскости анестезии.
- Обложка глаза животного с защитной мазью глазной сохранить глаза влажными во время анестезии, которая подавляет закрытием век животного. Удаление волос с головы животного использования бритвы, ножницы, ножницы, или химическими методами. Лечить кожи головы с использованием 10% повидон-раствор йода и 70% этанола. Все хирургические инструменты должны быть в автоклаве, стерилизуют стеклянные бусины-стерилизатор или дезинфицируют 70% этанола.
- Сделать средней линии разрез кожи головы с помощью небольших ножниц, начиная с 4-5 мм каудально по отношению к черепу и продвижения вперед к передней части глаза. Важно, что этот разрез быть достаточно длинными, чтобы кожа не будет вмешиваться в склеивании голове пластина, которая используется для стабилизации мыши голове в течение двух-фотонного томографии (рис. 1). Определить области, чтобы разбавлять при вскрытии области. Избегайте областей, представляющих интерес непосредственно расположенных над черепных швов, как череп менее стабильна в этих областях и основных крупных сосудов и мозговых оболочек будут мешать визуализации.
- Применять 100% этанолом, затем 10%-ным раствором хлорного железа с стерильный ватный тампон, чтобы высушить мембраны в верхней части черепа и очистить их прочь с использованием тонких пинцетом или лезвием бритвы. Ошибка удаления мембраны приводит к неустойчивой привязанности пластины голову.
- Место тонкий слой клея Permabond 910 по краям окна просмотра под голову тарелку. Место голове пластина покрыта клеем по площади процентов на череп животного с легким нажимом (рис. 1). Важно, чтобы голова пластина только приклеены к кости черепа. Любой кожи или мембран, которые находятся между пластиной голову и череп будет уменьшаться стабильность связи. Нанесите небольшое количество акрилатных вокруг окна просмотра с помощью шприца мгновенно связь клея. Наконец, нанесите небольшое количество Loctite 454 до краев смотровое окно для предотвращения утечек.
- Винт головой пластину животных держатель (рис. 1) и проверить стабильность голову пластины под рассечение объем, слегка зондирования с парой щипцов. Там должно быть никакого движения черепа по отношению к голове тарелку. Место падения физиологического раствора на окно просмотра для обеспечения Есть нет утечки.
2. Подготовка тоньше черепа Корковая Window
- В ходе подготовки к истончение череп, сухие черепа, используя комбинацию стерильные ватные тампоны и сжатого воздуха. Мы изначально тонкий череп с стерильных IRF 007 сверло в дрель Microtorque II установлена на уровне 4000 оборотов в минуту. Очень нежно, начинайте прореживание 2-2,5 мм в диаметре круговой области черепа. Используйте только легкие размашистые движения почти параллельно черепу; использовать не прямой понижательное давление. Стоп бурения каждые 20-30 секунд, чтобы удалить пыль при помощи костного сжатого воздуха. Эти перерывы в бурении позволяют черепа для охлаждения, так что нет тепла вызванного повреждения основной ткани мозга.
- Как бурения прогрессирует, обратите внимание, переход к влажным губчатый слой кости (т.е. "диплоэ"). Как только этот слой будет достигнута, упражнения дополнительное предостережение с дрелью.
- Время от времени проверять тонкость черепа путем размещения солевой более разбавленной области и просмотра под рассекает области. Соленая в дальнейшем позволяют рассеивания тепла. Как череп поредели, меньше сосудистой становится видимым.
- Использование стерильного стоматологического MicroBlade для достижения окончательного прореживания в условиях засоления, а MicroBlade предоставляет намного больше тактильной обратной связи по поводу стабильности черепа. Это позволяет гораздо тоньше, чем при подготовке сверлить в одиночку. По нашему опыту, оптимальная толщина черепа составляет 10-30 мкм.
- Важно проверить тонкость череп под epifluorescence несколько раз в течение первых нескольких попыток на то, чтобы тонким окном черепа. Резкость и глубину видимых микроглии и сосудистую дают хорошее представление о том, когда окно готово для работы с изображениями.
- Как только окно будет готово, клей на заказ прямоугольный кусок # 0 ш покровного стекла м размером менее 2 мм с каждой стороны за окном. Использование диаметром 1,0 мм стеклянную пипетку, поместите небольшую каплю клея на цианоакрилат разбавленной череп области и осторожно опустите вниз небольшой кусочек покровное, то слегка нажмите на черепе, чтобы отжать избыточное количество клея. Важно, чтобы избежать образования пузырьков между стеклом и клеем с захваченного воздуха приведет к области под стать оптически непрозрачных. Цианоакрилат клей используется, поскольку она остается прозрачным после высыхания, а также предотвращает кость и мембранные отрастания сохранность черепа под окном тонким и прозрачным. Если есть какие-либо клея на верхней части крышки стекла, использование MicroBlade осторожно удалите его один раз покровного стекла на месте и клей высохнет.
- Анальгетик (например, бупренорфин 2 мг / кг подкожно) вводят сразу после операции и вновь вводят в каких-либо признаков боли, в том числе нежелание двигаться, есть, ни пить, потеря веса, слюнотечение, пилоэрекции, дыхательных звуков, и т.д.
3. Двухфотонное изображений
- В ходе подготовки к двухфотонного изображения, покрывают TSCW физиологическим раствором и найти сферу интересов под epifluorescence (рис. 2). Для того чтобы последующие визуализации области, принимать изображения с помощью фотокамеры.
- В течение двух-фотонной обработки изображений, мы используем на заказ двухфотонного микроскопа 6 с титан-сапфирового лазера, настроенного на 920 нм. Флуоресценции обнаружена с помощью ФЭУ в целом поля режиме обнаружения и 580/180 выбросов фильтр. 20X воды погружения линз (0,95 NA) используется в визуализации сессии. Максимальный выходной мощности лазера на цель находится между 50 и 65 мВт.
- Выберите область интересов в корковых слоях я или II (до 150 мкм ниже пиальных поверхности). Для облегчения повторной обработки изображений, снимать же поле зрения скоростью 1x, 2x, а также 3-кратным цифровым зумом. Кровеносные сосуды могут служить в качестве ориентиров, чтобы легко найти то же самое поле зрения в течение последующих сессий визуализации. Под зум 3x, несколько Z-стеки с 80-90 Z-шаги в каждом стеке и 0,69 мкм шаг может быть приобретено через каждые 5 минут до 30 минут, что позволяет хорошая выборка микроглии морфологии и поведения с течением времени ( Рисунок 3). Между приобретения Z-стеки, следует проверить уровень физиологического раствора в течение TSCW, а также глубина животного анестезии.
4. Инъекция ВИЧ-1 Нейротоксин, Тат
- Во-первых, silanize внутренней оболочки иглой 35 и 10 мкл шприц микрообъеме для предотвращения Тат осаждения. Вывод silanizing решение (Sigmacote), пока она заполняет обе иглы и шприца. Разрешить решение, чтобы сидеть в течение 5 минут при комнатной температуре. Пустые решение от шприц, снимите поршень, и позволяют шприца и иглы до полного высыхания. Наконец, промойте шприц и иглу тщательно деионизированной водой.
- Выполните небольшое краниотомии диаметром 0,5 мм или 3 мм ростральной или сбоку от TSCW где двухфотонного изображения были получены с использованием меньшего сверло и тщательно истончение черепа, пока пара щипцов с острыми наконечниками можете удалить слой разбавленной кости от легко. Мы используем 10 мкл шприц микрообъеме оснащен 35 иглы контролируется шприц Ultramicropump III насос, установленный на 3-х осевой микроманипулятора и после выстраиваются иглы для трепанации черепа, он осторожно подошел к глубине от 700 до 900 мкм ниже пиальных поверхности, где 3 мкл Тат 1-72 (или других провоспалительных агентов) или физиологического раствора (или управление транспортным средством) поставляется в 80 л / мин.
5. Содержание животных
- Если животное для включения в образ несколько раз в течение одного дня, накрыть крышкой открытой площадке черепа со смесью мази глазной и вазелин для предотвращения дискомфорта или повреждения черепа между изображениями сессий. Отключите поддержку мост от маленькой головой пластины (рис. 1В) и поместить животное в клетку с нагревается легко доступной пищи и воды. Все животные должны быть размещены отдельно после операции в любое время. После визуализации сессий для животных полно тот или иной день, тщательно удалить всю голову пластину и шовный кожу назад на черепе с № 6 или меньше шва. Опять же, дом животных отдельно с легко доступной пищи и воды между экспериментальными дней. Проверьте животных ежедневно в течение каких-либо признаков стресса, боли, или инфекции.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. Стабилизация животных для хирургии и двухфотонного томография () и глава плиты (B).
Рисунок 2. GFP-меченых микроглии визуализированы с epifluorescence.
Рисунок 3. GFP-меченых микроглии визуализированы с двухфотонным изображений после имплантации TSCW, около 50 мкм ниже пиальных поверхности. Единый двухфотонного разделов приняты 15-30 минут после имплантации TSCW (день 0), а также 7 и 17 дней спустя, показали, что окна остается ясным пока остается микроглии выведен из эксплуатации в отсутствии воспалительных оскорбления. Z-проекции приняты 6 и 24 часов после инъекции нейротоксина ВИЧ-тат выставка впечатляет морфологические изменения активированной микроглии. Шкала бар: 10 мкм.
Discussion
Существует растущий консенсус, что фактический субстрат для ВИЧ-1-ассоциированные нейрокогнитивный дефицит (РУК) является разрушение синаптических архитектуры, предположительно вызванной провоспалительных медиаторов освобожден от инфицированных ВИЧ-1 мононуклеарных фагоцитов. Микроглии активации, многоядерные гигантские клетки, а из-за глиоз астроцитарных гипертрофии считаются неспецифические признаки ВИЧ-1 инфекции и воспаления в центральной нервной системе 7. В отличие от тяжести заболевания предсмертном периоде неврологические было связано с потерей синаптических сложности, а также макрофагов бремя в ЦНС 8,9,10,11. Тем не менее, динамическое взаимодействие между микроглии, периферической проникновения макрофагов и нейронов у пациентов с рук просто не могут быть смоделированы с использованием обычных статических обработки полученных из обычных иммуноцитохимического исследований. Последние исследования, проведенные в нашей лаборатории показали, что по крайней мере некоторые из этих взаимодействий между периферической и центральной мононуклеарных клеток и нейронов могут быть смоделированы при частичной стереотаксической инъекции ВИЧ-1 белок Tat 1-72 в паренхимы мозга (Lu, Маркер, Трамбле, Ци, и Гелбард, неопубликованные данные). Поэтому мы решили применить в естественных два изображения фотонов для изучения взаимодействия между моноцитарных макрофаги микроглии мозга резидентом и нейронов, в послушный маленькая модель животного для neuroAIDS. Хотя открытого черепа или в разреженных черепа подготовки позволить себе единый экзамен корковых архитектуры в течение короткого периода времени (часы), следователи заинтересованы в ход времени подострого события не могут использовать эти препараты без artifactually активации микроглии / макрофагов в связи с хирургической манипуляции свода окна. Здесь мы показываем, простой способ обойти это ограничение путем склеивания крошечный кусочек стекла покровного более разбавленной череп области предотвращения свода черепа с регенерирующим в TSCW а также поддержания прозрачности в течение ≥ 3 недель. Кроме того, мы показали, что этот метод позволяет нам контролировать поведение моноцитов в периферической ввода церебрального микроциркуляторного русла, а также мозг-нерезидентов микроглии в ответ на стереотаксической инъекции ВИЧ Тат 1-72 в коре головного мозга мышей гетерозиготных по CX 3 CR 1 / GFP ( выявить клетки мононуклеарных линии). Этот метод может быть легко адаптирована для использования на мышах с различными генетическими фона, например, мы обычно используем гетерозиготных CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 мышей для исследования взаимодействий между моноцитарных макрофаги микроглии мозга резидентом и нейронов в в естественных моделей neuroinflammation отношение к руке. Наши TSCW препарата позволяет исследователям для изучения межклеточных взаимодействий между периферией и ЦНС, которые могут возникнуть в течение периода недели, в котором животное может быть повторно отображаемого до и после экспериментального лечения. Таким образом, каждое животное может служить ее собственным контролем. Одно предостережение для этой модели TSCW в том, что клетки-мишени при расследовании должны быть либо генной инженерии, чтобы выразить расширенной флуоресцентных белков (eXFP) или быть помечены флуоресцентным красителем без механических нарушение свода черепа, и что выражение eXFP должен быть достаточно прочным, чтобы позволяют сотовой архитектурой для визуализации изображений после повторных сеансов в течение нескольких недель.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Эмили А. Келли за дизайн пластин головы.
Мы благодарны за поддержку награды NIH к HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 и щедрой поддержке Джеффри Waasdorp детской неврологии фонда, без которых эта работа не была бы возможна. АКМ финансируется NIH (EY019277), Уайтхолл, Фонд Альфреда П. Слоуна и Карьера премии в области биомедицинских наук от Burroughs Wellcome Фонд. MET финансируется Fonds-де-ла изысканная ан Sante Квебека (FRSQ) докторской награды обучения. DFM является стажером в медицинской программы подготовки ученых, финансируемых NIH T32 и T32 GM07356 AI049815.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | Hospira Inc. | ||
| Midazolam hydrochloride | Baxter Internationl Inc. | ||
| Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | |
| Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | ||
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | ||
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | |
| Cyanoacrylate | The Original Superglue | ||
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| 10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments, Inc. | ILS010LT | |
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| 35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments, Inc. | NL35BL-2 | |
| Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments, Inc. | 501860 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Mostany, R., &, P. ortera-C. ailliau, C, A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. 12, (2008).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, (2009).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).
- Jung, S. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).
- Mrsic-Flogel, T. D. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-96 (2007).
- Majewska, A., Yiu, G., &, Y. uste, R, A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).
- Sharer, L. R. Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system. A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).
- Everall, I. P., Aliberti, J., &, B. alcerzyk, M, Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia. Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).
- Masliah, E., Banati, R. B., &, Q. uinlan, M, E. Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders. Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).
- Everall, I. P., Banati, R. B., &, U. pender, B, M. Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder. Brain Pathol. 9, (1999).
- Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &, M. cA. rthur, C, J. Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia. Ann Neurol. 38, (1995).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (2000).
