Summary
Vi beskriver en metod för att upprepade gånger visualisera murina mikroglia och cirkulerande monocyter
Abstract
Traditionellt inom neurovetenskap, in vivo två photon avbildning av murina centrala nervsystemet har antingen involverade användningen av öppna skallen 1,2 eller tunnas-skalle 3 preparat. Medan den öppna-skalle teknik är mycket mångsidig, är det inte optimalt för att studera mikroglia eftersom det är invasiv och kan orsaka microglial aktivering. Även om förtunnas-skallen tillvägagångssätt är minimalt invasiv, upprepade på nytt gallring av skallen som krävs för kronisk avbildning ökar risken för vävnadsskada och microglial aktivering och tillåter ett begränsat antal avbildning sessioner. Här presenterar vi en kronisk tunn skalle fönster metod för övervakning av murina mikroglia in vivo under en längre tid med hjälp av två-photon mikroskopi. Vi visar hur man förbereder ett stabilt, tillgänglig, tunnat-skallen kortikal fönster (TSCW) med en apposed glas täckglas som återstår genomskinliga under loppet av tre veckor intermittent observation. Detta TSCW förberedelser är långt mer immunologiskt inerta med avseende på microglial aktivering än öppen kraniotomi eller upprepad skallen gallring och tillåter ett godtyckligt antal avbildning sessioner under en tidsperiod om veckor. Vi förbereder TSCW i CX 3 sp 1 GFP / + möss 4 att visualisera mikroglia med förbättrade grönt fluorescerande proteinet, ≤ 150 ìm under pial ytan. Vi visar också att denna beredning kan användas tillsammans med stereotaktisk hjärna injektioner av HIV-1 neurotoxiska protein Tat, som gränsar till TSCW, som kan framkalla hållbara microgliosis. Därför är denna metod mycket användbar för att undersöka förändringar i microglial morfologi och motilitet över tiden i den levande hjärnan i modeller av HIV-relaterade neurokognitiva Disorder (HAND) och andra neurodegenerativa sjukdomar med ett neuroinflammatoriska komponent.
Protocol
1. Förbereda djur för Imaging
- I våra experiment använder vi vuxna CX 3 sp 1 GFP / + möss som uttrycker GFP i mononukleära cell linjer, inklusive mikroglia. 4 olika stammar av möss kan användas för att tillgodose behoven hos ett specifikt projekt.
- Bedöva musen med en intraperitoneal injektion av en tre läkemedel cocktail bestående av 0,05 mg / kg Fentanyl, 5,0 mg / kg midazolam och 0,5 mg / kg medetomidin. 5 Kirurgiska förberedelse för TSCW börjar efter det att djuret inte längre reagerar på smärtsamma stimuli, till exempel som en svans nypa. Under hela operationen och bildhantering, behåller vi djur på en värmedyna för att förhindra post-anestesi hypotermi. Om det behövs, den ursprungliga dosen av bedövningsmedel cocktail en boosterdos av en tredjedel kan ges för att återställa den ursprungliga narkos planet.
- Täck djurets ögon med en skyddande oftalmologiska salva för att hålla ögonen fuktiga under narkos, undertrycker som djurets blinka reflex. Ta bort håret från hårbotten av djuret med en rakhyvel, sax, sax eller kemiska metoder. Desinficera hårbotten med en 10% povidon-jod-lösning och 70% etanol. Alla kirurgiska instrument måste autoklaveras, steriliseras med ett glas-pärla autoklav, eller desinficeras med 70% etanol.
- Gör en mittlinjen snitt i hårbotten med hjälp av en liten sax, med början 4-5 mm caudal till skallen och avancera framåt till framför ögonen. Det är viktigt att detta snitt vara tillräckligt lång för att huden inte kommer att störa limning av huvudet plåt som används för att stabilisera musen huvudet under två-photon imaging (Figur 1). Identifiera det område som ska gallras under en dissekera omfattning. Undvik områden av intresse direkt ligger över kraniala suturer, eftersom skallen är mindre stabil i dessa områden och underliggande stora fartyg och hjärnhinnorna kommer att störa avbildning.
- Applicera 100% etanol följt av 10%-lösning av järnklorid med en steril bomullspinne för att torka membran på toppen av skallen och skrapa bort dem med fin pincett eller ett rakblad. Underlåtenhet att ta bort membran resulterar i instabila huvudet tallrik fäste.
- Lägg ett tunt lager av Permabond 910 lim runt kanterna på fönstret under huvudet plattan. Placera huvudet platta med lim över det område av intresse för djurens skallen med ett lätt tryck (Figur 1). Det är viktigt att huvudet plattan bara limmas på ben i skallen. Alla hud eller slemhinnor som fångas mellan huvudet plattan och skallen minskar stabiliteten i obligationen. Applicera en liten mängd av akrylat runt fönstret med hjälp av en spruta för att omedelbart band limmet. Slutligen, fäst en liten mängd Loctite 454 till kanterna på fönstret för att förhindra läckage.
- Skruva huvudet plattan djuret hållaren (Figur 1) och kontrollera stabiliteten i huvudet plattan under en dissektion omfattning genom att lätt sondering med en pincett. Det bör inte rörelse av skallen i förhållande till huvudet plattan. Placera en droppe koksaltlösning på fönstret för att säkerställa att det inte finns några läckor.
2. Förbereda Gallrad Skull kortikala Fönster
- Som förberedelse för gallring skallen, torka skallen med en kombination av sterila tops och tryckluft. Vi tunt initialt skallen med en steril IRF 007 borr i en Microtorque II borren satt till 4000 rpm. Mycket försiktigt, börja gallring en 2-2,5 mm i diameter runda delen av skallen. Använd endast lätta svepande rörelser nästan parallell med skallen, använd inget direkt tryck nedåt. Sluta borra var 20-30 sekunder för att ta bort ben damm med tryckluft. Dessa avbrott i borrning låta skallen svalna så det finns ingen värme-inducerade skador på den underliggande hjärnvävnaden.
- Eftersom borrningen fortskrider, märker övergången till fuktigare porösa benet skiktet (dvs. "diploe"). När detta skikt är nådd, motion extra försiktighet med borren.
- Ibland kontrollera tunnhet av skallen genom att placera saltlösning över tunnas området och tittar under dissekera omfattning. Saline kommer att ytterligare stärka värmeavledning. Som skallen är förtunnas, blir mindre kärlsystem synlig.
- Använd en steril tandvård microblade att nå den slutliga gallringen i saltlösning, som microblade ger mycket mer taktil feedback om stabiliteten i skallen. Detta möjliggör mycket tunnare förberedelser än med borr ensam. Från vår erfarenhet är den optimala skallen tjocklek 10-30 ìm.
- Det är viktigt att kontrollera tunna skallen i epifluorescence flera gånger under de första försöken att göra en tunn skalle fönster. Den skärpa och djup av synliga mikroglia och kärlsystemet ge en bra indikation om när fönstret är klar för avbildning.
- När fönstret är redo, lim en skräddarsydd rektangulärt stycke # 0 coverglass wi th en dimension mindre än 2 mm på varje sida över fönstret. Använd en 1,0 mm pipett diameter glas, placera en liten droppe cyanoakrylat lim på tunnas skallen området och försiktigt sänka ner den lilla bit av täckglas och tryck försiktigt mot skallen för att pressa ut överskjutande beloppet av lim. Det är viktigt att undvika bubblor bildas mellan glaset och limma sedan instängd luft gör att området under för att bli optiskt ogenomskinlig. Den cyanoakrylat lim används för att det förblir öppen när det är torrt och förhindrar ben och membran återväxt hålla skallen under fönstret tunn och genomskinlig. Om det finns något lim på toppen av skyddsglas, använd microblade att försiktigt ta bort det när luckan glaset är på plats och limmet har torkat.
- Ett smärtstillande medel (till exempel buprenorfin 2 mg / kg sub-kutant) administreras omedelbart efter operationen och administreras på nytt vid varje tecken på smärta, bland annat ovilja att röra sig, äta eller dricka, viktminskning, salivering, piloerektion, andnings ljud, etc.
3. Två-foton Imaging
- Som en förberedelse för två-photon bildbehandling, täcka TSCW med koksaltlösning och leta reda på område av intresse i epifluorescence (Figur 2). För att möjliggöra efterföljande avbildning av området, ta en bild med en fotografisk kamera.
- För två-photon bildbehandling använder vi en skräddarsydd två-photon mikroskop 6 med en Ti: Sapphire lasern inställd på 920 nm. Fluorescens påvisas med hjälp av en fotomultiplikatorn rör i hel-fältet avkänningsläge och en 580/180 utsläpp filter. En 20x vatten nedsänkning lins (0,95 NA) används i hela avbildning sessionen. Den maximala effekt av laser effekt vid målet ligger mellan 50 och 65 mW.
- Välj ett område av intresse i kortikala skikt I eller II (upp till 150 ìm under pial ytan). För att underlätta vidareutnyttjande bildbehandling, ta bilder i samma synfält på 1x, 2x och 3x digital zoom. Blodkärl kan fungera som landmärken för att enkelt hitta samma synfält under efterföljande avbildning sessioner. Enligt en zoom på 3X, flera z-högar med 80-90 Z-stegen i varje stack och en 0,69 ìm steg kan förvärvas var 5 minuter upp till 30 minuter, vilket möjliggör en bra provtagning av microglial morfologi och beteende över tid ( Figur 3). Mellan förvärv av z-stackar, bör man kontrollera nivån på koksaltlösning över TSCW, liksom djurets djup anestesi.
4. Injektion av HIV-1 nervgift, Tat
- Först silaniseras innerfoder av en 35 gauge kanyl och 10 mikroliter Microvolume spruta för att förhindra Tat nedfall. Dra ut silanizing lösning (Sigmacote) tills den fyller både nål och spruta. Låt lösningen sitta i 5 minuter i rumstemperatur. Töm lösningen i sprutan, ta bort kolven och låt sprutan och kanylen för att torka helt. Slutligen, tvätta sprutan och nålen noggrant med avjoniserat vatten.
- Gör en liten kraniotomi 0,5 mm i diameter antingen 3 mm rostralt eller i sidled till TSCW där två-photon bilder har erhållits, med en mindre borr och försiktigt gallring skallen tills en pincett med vassa tips kan ta bort förtunnas lagret av ben undan lätt. Vi använder en 10 mikroliter Microvolume spruta med 35 gauge nål kontrolleras av en Ultramicropump III sprutpump monterad på en 3-axlig mikromanipulator och efter kö nålen spets till kraniotomi är det noga avancerat till ett djup av 700 till 900 ìm nedan den pial yta där 3 mikroliter Tat 1-72 (eller andra pro-inflammatoriska medel) eller koksaltlösning (eller kontroll fordon) levereras vid 80 Nl / min.
5. Djurstallar
- Om djuret ska avbildas flera gånger under en enda dag, täcker den öppna delen av skallen med en blandning av oftalmologiska salva och vaselin för att förhindra obehag eller skada på skallen i mellan avbildning sessioner. Koppla bort stödet bron från det lilla huvudet-platta (se figur 1B) och placera djuret i en varm bur med lättillgänglig mat och vatten. Alla djur ska hållas individuellt efter operationen hela tiden. När avbildning sessioner för ett djur är kompletta för en viss dag, försiktigt bort hela huvudet-platta och sutur i huden tillbaka över skallen med # 6 eller mindre sutur. Återigen hus djuren ensamma med lättillgänglig mat och vatten mellan experimentell dagar. Kontrollera djuren dagligen för tecken på stress, smärta eller infektion.
6. Representativa resultat
Figur 1. Stabilisering av djur för kirurgi och två-photon imaging (A) och huvudet platta design (B).
Figur 2. GFP-märkta mikroglia visualiseras med epifluorescence.
Figur 3. GFP-märkta mikroglia visualiseras med två-photon avbildning efter implantation av TSCW, ca 50 ìm under pial ytan. Den enda två-photon sektioner tas 15-30 minuter efter implantation av TSCW (dag 0) samt 7 och 17 dagar senare, visar att fönstren förblir tydligt samtidigt mikroglia förblir inaktiverat i avsaknad av inflammatorisk förolämpningar. Z-prognoser tas 6 och 24 timmar efter injektion av HIV neurotoxin tat uppvisar imponerande morfologiska förändringar av aktiverade mikroglia. Skala bar: 10 mikrometer.
Discussion
Det finns en ökande enighet om att det faktiska underlaget för HIV-1 associerad neurokognitiva brister (HAND) är förstörelse av synaptiska arkitektur, förmodligen orsakad av pro-inflammatoriska mediatorer frigörs från HIV-1 infekterade mononukleära fagocyter. Microglial aktivering, flerkärniga jätteceller och gliosis grund astrocytic hypertrofi anses ospecifik kännetecknar HIV-1 infektion och inflammation i CNS 7. Däremot har svårighetsgrad premortem neurologisk sjukdom varit korrelerad med förlusten av synaptiska komplexitet samt makrofager börda i CNS 8,9,10,11. Men bara dynamiska samspelet mellan mikroglia, perifer infiltrera makrofager och nervceller hos patienter med hand inte kan modelleras med konventionell statisk bearbetning från konventionella immuncytokemiska studier. Färska studier från våra laboratorier har föreslagit att åtminstone några av dessa interaktioner mellan perifera och centrala mononukleära celler och nervceller kan modelleras delvis av stereotaktisk injektion av HIV-1-proteinet Tat 1-72 i hjärnparenkymet (Lu, Marker, Tremblay, Qi, och Gelbard, opublicerade data). Vi beslutade därför att tillämpa in vivo två photon imaging att undersöka samspelet mellan monocyte-derived makrofager, hjärna bosatt mikroglia och nervceller, i en lätthanterlig liten djurmodell för neuroAIDS. Medan öppen skalle eller tunnas-skallen förberedelser råd med en enda undersökning av kortikal arkitektur för en kort tid (timmar), utredare intresserad av tiden under subakut händelser kan inte använda dessa preparat utan artifactually aktivera mikroglia / makrofager grund av kirurgisk manipulation av den calvarial fönstret. Här visar vi ett enkelt sätt att kringgå dessa begränsningar genom att limma en liten glasbit täckglas över förtunnas skallen området hindrar calvarium från regenererande i TSCW samt behålla genomskinlighet i ≥ 3 veckor. Vi visar vidare att denna teknik gör att vi kan bevaka hur de perifera monocyter in cerebral mikrocirkulation samt hjärna hemmahörande mikroglia som svar på stereotaktisk injektion av hiv Tat 1-72 i hjärnbarken hos mus heterozygot för CX 3 CR 1 / GFP ( att identifiera celler av mononukleära härstamning). Denna teknik kan enkelt anpassas till användning på möss med olika genetiska bakgrund, till exempel, vi rutinmässigt använder heterozygot CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 mus för att undersöka interaktioner mellan monocyte-derived makrofager, hjärna mikroglia inhemska och nervceller i in vivo-modeller av neuroinflammation relevant till hands. Vår TSCW förberedelse låter utredare för att studera cell-cell interaktioner mellan periferin och CNS som kan uppstå under perioder om veckor, i vilket djuret kan upprepade gånger avbildas före och efter experimentell behandling. Således kan varje djur fungera som sin egen kontroll. En varning för denna TSCW modell är att målet cellerna under utredning behöver vara antingen genetiskt modifierade att uttrycka förbättrade fluorescerande proteiner (eXFP) eller vara märkta med en fluorescerande färg utan mekaniska brott mot calvarium, och att eXFP uttryck måste vara robust nog att tillåter cellulära arkitektur ska visualiseras efter upprepad avbildning sessioner under en period av veckor.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Emily A. Kelly för huvudet plattan design.
Vi är tacksamma för stödet från NIH utmärkelser till HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 och generöst stöd för Geoffrey Waasdorp neuropediatrik fonden utan vilket detta arbete inte varit möjligt. AKM finansieras av NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Alfred P. Sloan Foundation och en karriär Award i biomedicin från Burroughs Wellcome Fund. MET är finansierad av en Fonds de la recherche en Sante du Quebec (FRSQ) postdoktoral utbildning utmärkelse. DFM är en praktikant i Medical Scientist Training Program, som finansieras av NIH T32 GM07356 och T32 AI049815.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | Hospira Inc. | ||
| Midazolam hydrochloride | Baxter Internationl Inc. | ||
| Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | |
| Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | ||
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | ||
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | |
| Cyanoacrylate | The Original Superglue | ||
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| 10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments, Inc. | ILS010LT | |
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| 35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments, Inc. | NL35BL-2 | |
| Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments, Inc. | 501860 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Mostany, R., &, P. ortera-C. ailliau, C, A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. 12, (2008).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, (2009).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).
- Jung, S. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).
- Mrsic-Flogel, T. D. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-96 (2007).
- Majewska, A., Yiu, G., &, Y. uste, R, A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).
- Sharer, L. R. Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system. A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).
- Everall, I. P., Aliberti, J., &, B. alcerzyk, M, Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia. Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).
- Masliah, E., Banati, R. B., &, Q. uinlan, M, E. Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders. Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).
- Everall, I. P., Banati, R. B., &, U. pender, B, M. Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder. Brain Pathol. 9, (1999).
- Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &, M. cA. rthur, C, J. Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia. Ann Neurol. 38, (1995).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (2000).
