Summary
Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem tarif
Abstract
Geleneksel nörobilim in vivo fare ve merkezi sinir sisteminin iki foton görüntüleme veya açık kafatası 1,2 veya 3 hazırlıkları inceltilmiş-kafatası yer vardır . Açık kafatası tekniği çok yönlü olmakla birlikte invazif ve mikroglial aktivasyon neden olabileceğinden, mikroglia eğitim için optimal değildir. Inceltilmiş kafatası yaklaşım minimal invaziv olmasına rağmen, kronik görüntüleme için gerekli kafatasının yeniden inceltme tekrarlanan doku hasarı ve mikrogliyal aktivasyon riskleri artırır ve görüntüleme oturumları sınırlı sayıda sağlar. Burada iki foton mikroskopi kullanılarak zaman uzun bir süre boyunca in vivo fare mikroglia izlenmesi için kronik bir kafatası ince pencere yöntemi mevcut. Biz istikrarlı, erişilebilir, inceltilmiş kafatası kortikal pencere (TSCW) aralıklı gözlem üç hafta boyunca yarı saydam kalır bir apposed cam lamel nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu TSCW hazırlık, çok daha inceltme açık kraniotomi veya tekrarlanan kafatası daha mikroglia aktivasyonu açısından immünolojik asal keyfi bir görüntüleme oturumları sayısı ve haftalık bir süre içinde sağlar. ≤ 150 mm pial yüzeyinin altında gelişmiş yeşil flüoresan protein ile mikroglia görselleştirmek için CX 3 CR 1 GFP / + fareler 4 TSCW hazırlar. Biz de bu hazırlık dayanıklı microgliosis tetikleme kapasitesine sahiptir TSCW bitişik Tat HIV-1 nörotoksik protein, stereotaktik beyin enjeksiyonları ile birlikte kullanılabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu yöntem, HIV Associated Nörobilişsel Bozukluğu (EL) ve yöntemine işaret bileşeni ile diğer nörodejeneratif hastalıklar modelleri canlı beyin zamanla mikrogliyal morfoloji ve motilite değişiklikleri incelemek için son derece yararlı.
Protocol
1. Hayvan Görüntüleme için hazırlanması
- Deneylerde, biz ifade GFP. Mikroglia dahil olmak üzere mononükleer hücre soyları, farelerin 4 Farklı suşlar belirli bir proje ihtiyaçlarını karşılamak için kullanılabilir olması yetişkin CX 3 CR 1 GFP / + fareler kullanın.
- Hayvan artık ağrılı uyaranlara yanıt verir sonra intraperitoneal enjeksiyonu ile 0.05 mg / kg fentanil, 5.0 mg / kg midazolam ve 0.5 mg / kg Medetomidine oluşan üç ilaç kokteyli fare anestezisi. TSCW için 5 Cerrahi hazırlık başlar gibi kuyruk tutam. Cerrahi ve görüntüleme boyunca, anestezi sonrası hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde hayvan tutun. Gerekirse, üçte biri bir rapel doz anestezik kokteyl orijinal dozunun orijinal anestezi uçağı geri yüklemek için verilen olabilir.
- Anestezi sırasında gözleri nemli tutmak için koruyucu bir oftalmik merhem Kapak hayvanın gözleri, hayvanın göz kırpma refleksi bastırır. Bir jilet kullanarak hayvanın derisi saç, makaslar, makas, ya da kimyasal yöntemlerle çıkarın. % 10 povidon-iyot çözeltisi ve% 70 etanol ile saçlı deri dezenfekte edin. Tüm cerrahi aletler, cam boncuk sterilizatör, veya% 70 etanol ile dezenfekte ile sterilize otoklava gerekir.
- , Küçük bir makas kullanarak kafa derisi kafatasına kaudal 4-5 mm başlangıç ve ileri gözleri önünde ilerleyen bir orta hat kesi olun. Bu kesi cilt sırasında fare kafası iki foton görüntüleme (Şekil 1) stabilize etmek için kullanılır kafa plaka yapıştırma engel olmaz yeterince uzun olması önemlidir. Diseksiyon kapsamında inceltilerek alan tanımlayın. Kafatası bu alanlarda daha az istikrarlı ve büyük damarların ve meninks altta yatan görüntüleme ile engel olacak şekilde, doğrudan kraniyal sütür üzerinde bulunan ilgi alanları kaçının.
- Kafatasının üst membranlar kuru ve ince cımbız ya da jilet kullanarak ellerinden kazımak için steril bir pamuklu bir bez ile ferrik klorür% 10 çözüm% 100 etanol uygulayın. Kararsız kafası plaka eki zarların sonuçları kaldırmak için başarısız.
- Permabond 910 yapıştırıcı kafa plaka altında izleme penceresinin kenarlarında ince bir tabaka yerleştirin. Yapıştırıcı ile kaplanmış hafif bir basınç (Şekil 1) Hayvanın kafatası ilgi alanı içinde kafa plaka koyun. Kafa plaka sadece kafatasının kemik yapıştırılmış olduğu önemlidir. Kafa plaka ve kafatası arasında sıkışmış herhangi bir deri ya da membranlar bağ istikrar azalacaktır. Akrilat anında bir şırınga bağ tutkal kullanarak görüntüleme penceresi etrafında küçük bir miktar uygulayın. Son olarak, Loctite 454 görüntüleme pencere kenarlarına sızıntılarını önlemek için küçük bir miktar uygulanır.
- (Şekil 1) hayvan sahibinin baş plaka Vida ve forseps bir çift ile hafifçe problama bir diseksiyon kapsamında başkanı plaka stabilite kontrol. Kafa plakasına göre kafatası hiçbir hareket olmamalıdır. Herhangi bir sızıntı olmadığından emin olmak için izleme penceresi üzerine bir damla serum fizyolojik yerleştirin.
2. İnceltilen Kafatası Kortikal Pencere hazırlanması
- Kafatası inceltme için hazırlık kafatası, steril pamuklu ve basınçlı hava bir arada kullanarak kurutun. 4000 rpm'de Microtorque II matkap steril bir IRF 007 matkap ucu ile kafatası Biz başlangıçta ince. Çok nazik, kafatasının 2-2.5 mm çaplı dairesel alanda incelme başlar. , Kafatasının hemen hemen paralel, sadece hafif süpürme hareketleri kullanın; hiçbir doğrudan aşağı yönlü baskı kullanabilirsiniz. Basınçlı hava kullanarak kemik tozu kaldırmak için her 20-30 saniyede bir delme işlemini durdurun. Bu sondaj tatili, altta yatan bir beyin dokusu ısıya bağlı hasar var kafatası soğumasını bekleyin.
- Delme ilerledikçe, nemli süngerimsi kemik tabaka (yani "diploe") geçiş dikkat edin. Bu katman ulaşıldığında, matkap ekstra dikkatli.
- Bazen inceltilmiş alana tuzlu yerleştirerek ve diseksiyon kapsamında izleme kafatası inceliği kontrol edin. Tuzlu daha fazla ısı dağılımı sağlayacaktır. Kafatası inceltilmiş olduğu gibi, küçük damarsal görünür hale gelir.
- MicroBlade kafatası istikrar konusunda daha çok dokunsal geribildirim sağlar, tuzlu su altında final incelme elde etmek için steril bir diş MicroBlade kullanın. Bu sadece matkap ile çok daha ince hazırlıkları için sağlar. Deneyimlerimizi, optimal kafatası kalınlığı 10-30 mikron.
- Epifloresans birden çok kez altında ince bir kafatası penceresi ilk birkaç girişimleri sırasında kafatasının inceliği kontrol etmek için önemlidir. Görünür mikroglia ve damarsal netlik ve derinlik pencere görüntüleme için hazır olduğunda iyi bir gösterge verir.
- Sonra pencere tutkal # 0 coverglass wi ısmarlama bir dikdörtgen parça hazırdır Pencerenin üzerinde her iki tarafta en az 2 mm boyut th. 1.0 mm çaplı cam pipet kullanarak, siyanoakrilat yapıştırıcı inceltilmiş kafatası alan üzerine küçük bir damla koyun ve küçük bir parça aşağı lamel dikkatlice düşük, daha sonra aşırı miktarda tutkal sıkmak kafatası karşı hafifçe bastırın. Optik opak hale altında hapsolmuş hava alanı yol açacağından cam ve tutkal arasında kabarcık oluşumunu önlemek için önemlidir. Ne zaman kuru saydam kalır ve aynı zamanda kemik ve kafatası ince ve saydam pencerenin altında tutmak membran regrowth engeller çünkü siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılır. Kapak cam üstünde herhangi bir yapıştırıcı varsa, kapağı cam ve tutkal kuruduktan sonra dikkatlice kaldırmak için MicroBlade kullanın.
- Bir analjezik (örneğin, Buprenorfin 2 mg / kg alt-kutanöz), kilo kaybı, salivasyon, piloerection, solunum sesleri, hareket yemek veya içmek için isteksizlik dahil olmak üzere, ameliyat sonrası hemen idare ve yeniden uygulandığında ağrı herhangi bir işaret vs.
3. İki foton Görüntüleme
- Iki foton görüntüleme için hazırlık olarak, tuzlu su ile TSCW kapak ve Epifloresans altında ilgi alanı (Şekil 2) bulun. Sonraki görüntü alanı sağlamak için, fotoğrafik bir kamerayı kullanarak bir resim çekmek.
- Sapphire lazer 920 nm ayarlı iki foton görüntüleme için, bir Ti ile ısmarlama iki foton mikroskop 6 kullanın. Floresans tüm alan algılama modu ve 580/180 emisyon filtresi photomultiplier tüp kullanılarak tespit edilir. A 20X su daldırma lens (0.95 NA) görüntüleme oturum boyunca kullanılır. 50 ve 65 mW arasında maksimum çıkış amacı lazer güç ayarlanır.
- Kortikal tabakalar halinde, ilgi alanı I veya II (pial yüzeyinin altında 150 mikron kadar). Yeniden görüntüleme kolaylaştırmak için 1X, 2X, aynı alanda fotoğraflarını çekmek ve 3X dijital zoom. Kan damarları, aynı alanda kolayca sonraki görüntüleme oturumları sırasında bulmak için nirengi noktaları gibi hizmet edebilir. 80-90 ile bir zoom 3X, çoklu z yığınları altında Z-her yığını ve 0.69 mikron adım adımları (mikrogliyal morfoloji ve davranış zamanla iyi bir örnekleme sağlayan 30 dakika için her 5 dakikada elde edilebilir Şekil 3). Z yığınlarının satın almalar arasında, bir TSCW üzerine tuzlu su seviyesi, yanı sıra hayvan anestezi derinliği doğrulamanız gerekir.
4. HIV-1 nörotoksin, Tat enjeksiyon
- Birincisi, 35 gauge iğne ve Tat birikmesini önlemek için 10 mcL Microvolume şırınga iç astar silanize. Silanizing solüsyonu (Sigmacote) hem iğne ve şırınga doldurana kadar çekin. Oda sıcaklığında 5 dakika oturup çözüm izin verin. Boş şırınga çözüm, piston kaldırmak ve şırınga ve iğne tamamen kurumasını bekleyin. Son olarak, deiyonize su ile iyice şırınga ve iğne yıkayın.
- Çapı da daha küçük bir matkap ucu kullanarak 3 mm rostral veya iki foton görüntüler elde edilmiştir TSCW lateral yapın ve küçük bir kraniotomi 0,5 mm, keskin uçları ile forseps bir çift dikkatle kadar kafatası inceltme inceltilmiş katman kaldırabilirsiniz. kolayca kemik. Biz, 3-eksenli mikromanipülatör ve kraniotomi iğne ucu kadar astar sonra monte bir Ultramicropump III şırınga pompası tarafından kontrol edilen 35 gauge iğne ile donatılmış 10 mcL Microvolume şırınga kullanımı, altında 900 mm ile 700 derinliğe kadar dikkatli bir şekilde gelişmiş. pial yüzey 3 mcL Tat 1-72 (veya diğer pro-inflamatuar ilaçlar) ya da tuzlu su (veya kontrol aracı) 80 nL / dak teslim edilir.
5. Hayvan Barınakları
- Hayvan, tek bir gün içinde birden çok kez görüntülenmiş ise, oftalmik merhem ve görüntüleme oturumları arasında rahatsızlık veya kafatası hasar görmesini önlemek için vazelin karışımı ile kafatası açık bir alanı kapsayacak. Küçük baş-plaka (bkz. Şekil 1B) destek köprü bağlantısını kesin ve kolay erişilebilir yiyecek ve su ile ısıtılmış bir kafeste hayvan. Bütün hayvanlar her zaman cerrahi sonrası tek başına ev sahipliği için. Belirli bir günde bir hayvan için görüntüleme oturumlar tamamlandıktan sonra, dikkatle, tüm baş plakalı kaldırmak ve kafatası üzerinde # 6 ya da daha küçük bir dikiş ile cilt sütür. Yine, deneysel gün arasında kolayca erişilebilir yiyecek ve su ile tek tek hayvanların ev. Hayvanlar için günlük herhangi bir stres belirtileri, ağrı, ya da enfeksiyon kontrol edin.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 cerrahi ve iki foton görüntüleme (A) ve kafa plaka tasarım (B) için hayvan Sabitleme.
Şekil 2 GFP etiketli mikroglia Epifloresans ile görüntülendi.
Şekil 3. GFP etiketli mikroglia TSCW implantasyonu sonra iki foton görüntüleme ile görüntülendi pial yüzeyinin altında, yaklaşık 50 mikron TSCW implantasyonu (gün 0) 15-30 dakika sonra alınan tek iki foton bölümler yanı sıra, 7 ve 17 gün sonra, mikroglia inflamatuar hakaret yokluğunda inaktive devam ederken, pencereler açık kalmasını göstermektedir. Z-projeksiyonlar 6 alınmış ve 24 saat aktif mikroglia HIV nörotoksin tat sergi etkileyici morfolojik değişiklikler sonrası enjeksiyon. Ölçek çubuğu: 10 mm.
Discussion
HIV-1 ile ilişkili bilişsel açıkları (EL) için gerçek bir substrat muhtemelen HIV-1 mononükleer fagositler serbest pro-inflamatuvar mediatörlerin neden olduğu yıkım, sinaptik mimarisi olduğunu artan bir fikir birliği yoktur. Mikroglia aktivasyonu, çok çekirdekli dev hücreler ve astrositik hipertrofisi nedeniyle gliozis 7 CNS HIV-1 enfeksiyon ve enflamasyonun nonspesifik işaretlerinden kabul edilir. Buna karşılık, sinaptik karmaşıklığı kaybı, CNS 8,9,10,11 makrofaj yükünün yanı sıra premortem nörolojik hastalığın şiddeti ile korele edilmiştir. Ancak, mikroglia, periferik infiltre eden makrofaj ve EL ile hasta nöronlar arasındaki dinamik etkileşimler sadece geleneksel immünositokimyasal çalışmalarda elde edilen geleneksel statik işleme kullanarak modellenebilir olamaz. Laboratuarlarımızda Son çalışmalar, periferik ve santral mononükleer hücreleri ve nöronlar arasındaki bu etkileşimlerin en azından bazı HIV-1 proteininin Tat 1-72 stereotaktik beyin parankiminin (Lu, Marker, Tremblay, içine enjeksiyon bölümünde modellenebilir olduğunu ileri sürmüşlerdir Qi ve Gelbard, yayınlanmamış veri). Bu nedenle, neuroAIDS için izlenebilir küçük bir hayvan modeli, in vivo iki foton görüntüleme monosit kökenli makrofajlar, beyin ikamet mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için uygulamaya karar verdi . Açık-kafatası ya da inceltilmiş-kafatası hazırlıkları zaman bir kısa bir süre (saat) kortikal mimari bir tek muayene, subakut olaylar zaman elbette artifactually, cerrahi manipülasyon nedeniyle mikroglia / makrofaj aktive olmadan bu hazırlıkların kullanmak değil. Ilgilenen Alan İnceleme göze iken kalvarial pencere. Burada basit bir şekilde yapıştırma TSCW yenileyici kalvaryumda önlemenin yanı sıra ≥ 3 hafta translusensi sağlamak cam lamel inceltilmiş kafatası alan üzerinde küçük bir parça bu sınırlama engellemeyi göstermektedir. Biz daha bu tekniği bize (CX 3 CR 1 / GFP için heterozigot farelerin korteks HIV Tat 1-72 stereotaktik enjeksiyon yanıt yanı sıra beyin-yerleşik mikroglia beyin mikrovasküler giren periferik monositler davranışlarını izlemek için izin verdiğini göstermek mononükleer soy hücreleri belirlemek için). Bu teknik, farklı genetik geçmişleri olan fareler üzerinde kullanmak için kolayca adapte olabilir, örneğin, rutin heterozigot CX 3 CR 1 / GFP kullanmak X Thy-1, monosit kökenli makrofajlar, beyin ikamet mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimi araştırmak için YFP 12 fareler EL ile ilgili nöro in vivo modeller. Bizim TSCW hazırlanması, araştırmacılar, çevre ve hayvan deneysel tedavi öncesi ve sonrasında sürekli görüntülü hangi hafta süreleri, üzerinde oluşabilir MSS arasında hücre-hücre etkileşimleri çalışma sağlar. Böylece, her hayvan, kendi kontrolü olarak hizmet verebilir. Bu TSCW model için bir ihtar soruşturma kapsamında hedef hücreleri ya genetik olarak geliştirilmiş floresan proteinleri (eXFP) ifade veya kalvaryumda mekanik ihlali olmadan bir floresan boya ile etiketlenmiş tasarlanmıştır gerektiğini ve bu eXFP ifade yeterince güçlü olmalıdır haftalık bir süre içinde tekrarlanan görüntüleme seans sonrası hücresel mimarisi görüntülenmiştir izin.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Emily A. Kara kafa plaka tasarımı için teşekkür ederim.
NIH ödül HAG destek için minnettarız: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 ve bu işi mümkün olmazdı onsuz Geoffrey Waasdorp Pediatrik Nöroloji Fonu cömert desteği. AKM Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Alfred P. Sloan Vakfı ve Kariyer Ödülü Burroughs Wellcome Fonu Biyomedikal Bilimler tarafından finanse edilmektedir. MET Viyana de la recherche tr Sante du Quebec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir. DFM NIH, T32 GM07356 ve T32 AI049815 tarafından finanse Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı, bir stajyer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | Hospira Inc. | ||
| Midazolam hydrochloride | Baxter Internationl Inc. | ||
| Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | |
| Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | ||
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | ||
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | |
| Cyanoacrylate | The Original Superglue | ||
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| 10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments, Inc. | ILS010LT | |
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| 35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments, Inc. | NL35BL-2 | |
| Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments, Inc. | 501860 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Mostany, R., &, P. ortera-C. ailliau, C, A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. 12, (2008).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, (2009).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).
- Jung, S. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).
- Mrsic-Flogel, T. D. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-96 (2007).
- Majewska, A., Yiu, G., &, Y. uste, R, A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).
- Sharer, L. R. Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system. A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).
- Everall, I. P., Aliberti, J., &, B. alcerzyk, M, Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia. Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).
- Masliah, E., Banati, R. B., &, Q. uinlan, M, E. Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders. Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).
- Everall, I. P., Banati, R. B., &, U. pender, B, M. Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder. Brain Pathol. 9, (1999).
- Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &, M. cA. rthur, C, J. Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia. Ann Neurol. 38, (1995).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (2000).
