हम बार बार murine microglia visualizing और monocytes परिसंचारी के लिए एक विधि का वर्णन<em> Vivo में</em> घंटे, दिन, या transcranial माइक्रोस्कोपी दो photon का उपयोग सप्ताह से अधिक. हम प्रदर्शन कैसे तैयार करने के लिए एक खिड़की thinned – खोपड़ी है कि मौन microglia है कि जैसे एचआईवी-1 नियामक प्रोटीन के बगल stereotactic इंजेक्शन से सक्रिय किया जा सकता के आंतरायिक अवलोकन की अनुमति देता है.
परंपरागत रूप से तंत्रिका विज्ञान में, vivo में दो murine केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के फोटॉन इमेजिंग या तो खुले खोपड़ी 1,2 या thinned – खोपड़ी 3 की तैयारी का उपयोग शामिल किया गया है . हालांकि खोपड़ी खुले तकनीक बहुत बहुमुखी है, यह microglia के अध्ययन के लिए इष्टतम नहीं है क्योंकि यह आक्रामक है और microglial सक्रियण पैदा कर सकता है. हालांकि thinned – खोपड़ी दृष्टिकोण न्यूनतम इनवेसिव है, दोहराया फिर से पुरानी इमेजिंग के लिए आवश्यक खोपड़ी के thinning के ऊतकों को चोट और microglial सक्रियण के जोखिम को बढ़ाता है और इमेजिंग सत्र की एक सीमित संख्या के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम एक पुरानी पतली खोपड़ी दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग समय की एक विस्तारित अवधि में vivo में murine microglia की निगरानी के लिए विंडो विधि प्रस्तुत करते हैं . हम प्रदर्शन कैसे एक apposed कांच coverslip है कि आंतरायिक अवलोकन के तीन सप्ताह के पाठ्यक्रम पर पारदर्शी रहता है के साथ एक स्थिर, सुलभ, thinned – खोपड़ी cortical विंडो (TSCW) तैयार करने के लिए. इस TSCW तैयारी खुला craniotomy या दोहराया खोपड़ी thinning से microglial सक्रियण के लिए सम्मान के साथ immunologically निष्क्रिय दूर है और सप्ताह की एक समय अवधि के दौरान की अनुमति देता है इमेजिंग सत्र के एक मनमाना संख्या है. हम CX 3 सीआर 1 GFP / + 4 चूहों में TSCW तैयार microglia बढ़ाया ≤ pial सतह के नीचे 150 सुक्ष्ममापी के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ कल्पना. हम यह भी पता चलता है कि इस तैयारी एचआईवी -1 neurotoxic, जैसे प्रोटीन, TSCW है, जो टिकाऊ microgliosis उत्प्रेरण के लिए सक्षम है करने के लिए निकट के stereotactic मस्तिष्क इंजेक्शन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, इस विधि microglial और समय पर आकारिकी गतिशीलता में एचआईवी एसोसिएटेड Neurocognitive (हाथ) विकार और अन्य neurodegenerative रोगों के एक neuroinflammatory घटक के साथ मॉडल में रहने वाले मस्तिष्क में परिवर्तन की जांच के लिए अत्यंत उपयोगी है.
बढ़ती आम सहमति है कि एचआईवी-1 से जुड़े neurocognitive घाटे (हाथ) के लिए वास्तविक सब्सट्रेट synaptic वास्तुकला का विनाश, संभाव्यतः समर्थक भड़काऊ एचआईवी -1 से संक्रमित mononuclear phagocytes से जारी मध्यस्थों की वजह से है. Microglial सक्रियण, multinucleated विशाल कोशिकाओं, और astrocytic अतिवृद्धि के कारण gliosis एचआईवी-1 और 7 CNS में संक्रमण सूजन के nonspecific पहचान माना जाता है. इसके विपरीत, premortem neurologic रोग की गंभीरता synaptic जटिलता के नुकसान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 8,9,10,11 CNS में बृहतभक्षककोशिका बोझ के साथ सहसंबद्ध किया गया है . हालांकि, microglia, परिधीय घुसपैठ मैक्रोफेज, और हाथ के साथ रोगियों में न्यूरॉन्स के बीच गतिशील बातचीत बस पारंपरिक स्थैतिक पारंपरिक immunocytochemical अध्ययन से प्राप्त प्रसंस्करण का उपयोग नहीं किया जा मॉडलिंग कर सकते हैं. हमारी प्रयोगशालाओं से हाल के अध्ययनों से सुझाव दिया है कि कम से कम परिधीय और केंद्रीय mononuclear कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच इन संबंधों के कुछ हिस्से में एचआईवी -1 प्रोटीन 1-72 जैसे stereotactic इंजेक्शन द्वारा किया जा सकता है मस्तिष्क parenchyma (लू, मार्कर, Tremblay में modeled, क्यूई, और Gelbard, अप्रकाशित डेटा). इसलिए हम vivo में दो photon इमेजिंग में लागू monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज, मस्तिष्क निवासी microglia और न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया की जांच करने का फैसला किया, एक विनयशील neuroAIDS के लिए छोटे पशु मॉडल में. जबकि खुले खोपड़ी या thinned – खोपड़ी की तैयारियाँ समय (घंटे) का एक संक्षिप्त अवधि के लिए एक cortical वास्तुकला का एक परीक्षा, subacute घटनाओं के समय के पाठ्यक्रम में artifactually के सर्जिकल हेरफेर करने के लिए कारण microglia / बृहतभक्षककोशिका सक्रिय किए बिना इन तैयारियों का उपयोग नहीं कर सकते हैं रुचि रखते जांचकर्ताओं बर्दाश्त calvarial खिड़की. यहाँ हम thinned खोपड़ी क्षेत्र पर एक गिलास coverslip regenerating से TSCW में calvarium के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोकने translucency ≥ 3 सप्ताह के लिए बनाए रखने के छोटे टुकड़े gluing द्वारा इन सीमा circumventing का एक आसान तरीका प्रदर्शित करता है. हम आगे दिखाना है कि इस तकनीक हमें CX 3 1 सीआर / GFP के लिए विषमयुग्मजी चूहों के प्रांतस्था में एचआईवी जैसे 1-72 के stereotactic इंजेक्शन के जवाब में मस्तिष्क के रूप में अच्छी तरह के रूप में मस्तिष्क निवासी microglia microvasculature में प्रवेश परिधीय monocytes के व्यवहार पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है ( mononuclear वंश की कोशिकाओं की पहचान). इस तकनीक को आसानी से अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहों पर प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हम नियमित विषमयुग्मजी CX 3 1 सीआर / GFP उपयोग X तेरा 1 YFP 12 चूहों monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज, मस्तिष्क निवासी microglia और में न्यूरॉन्स के बीच बातचीत जांच हाथ करने के लिए प्रासंगिक neuroinflammation के vivo मॉडल में. हमारे TSCW तैयारी जांचकर्ताओं सेल सेल परिधि और सीएनएस है कि सप्ताह की अवधि, जिसमें पशु बार बार प्रयोगात्मक उपचार के पहले और बाद में imaged किया जा सकता है पर हो सकता है के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, प्रत्येक जानवर अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं. इस TSCW मॉडल के लिए एक चेतावनी है कि जांच के तहत लक्ष्य कोशिकाओं या तो आनुवंशिक बढ़ाया फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eXFP) व्यक्त या calvarium यांत्रिक उल्लंघन के बिना एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल इंजीनियर होने की जरूरत है, और कि eXFP अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त मजबूत किया जाना चाहिए सेलुलर वास्तुकला सप्ताह की अवधि से अधिक दोहराया इमेजिंग सत्र के बाद visualized किया जा अनुमति देते हैं.
The authors have nothing to disclose.
हम एमिली ए केली सिर थाली डिजाइन के लिए धन्यवाद.
हम NIH पुरस्कारों की डायन के लिए समर्थन के लिए आभारी हैं: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 और जेफ्री Waasdorp बाल चिकित्सा तंत्रिका विज्ञान कोष जिसके बिना यह काम संभव नहीं होता की उदार सहायता. AKM एनआईएच (EY019277), व्हाइटहॉल फाउंडेशन, अल्फ्रेड पी. स्लोअन फाउंडेशन और Burroughs Wellcome कोष से बायोमेडिकल साइंसेज में एक कैरियर पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित है. मिले एक Fonds डी ला Recherche एन SANTE डु (FRSQ) postdoctoral प्रशिक्षण पुरस्कार क्यूबेक द्वारा वित्त पोषित है. DFM चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम, NIH GM07356 T32 और AI049815 T32 द्वारा वित्त पोषित में एक प्रशिक्षु है.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |