我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。<em> in vivoで</em>経頭蓋二光子顕微鏡を用いて数時間、数日または数週間にわたって。我々は、HIV – 1調節タンパク質タットの隣接定位注入によって活性化することができる静止ミクログリアの断続的な観察を可能にする間伐 – 頭蓋骨のウィンドウを準備する方法を示します。
伝統的に神経科学では、in vivoでマウス中枢神経系の二光子イメージングには、どちらのオープン頭蓋骨の1,2または間引き頭蓋骨3製剤の使用に関与している。オープン頭蓋骨のテクニックは非常に汎用性ですが、それは侵襲的であるため、ミクログリアを研究するための最適ではありませんし、ミクログリアの活性化を引き起こす可能性があります。間伐-頭蓋骨のアプローチは、低侵襲であるにもかかわらず、繰り返し再間伐頭蓋骨の慢性的イメージングに必要な、組織の損傷とミクログリア活性化のリスクを増加させ、イメージングセッションの限られた数を可能にする。ここでは、2光子顕微鏡を使用して、長期間にわたってin vivoでのマウスのミクログリアを監視するための慢性的な薄頭蓋骨のウィンドウ法を提案する。私たちは、断続的な観察の三週間の経過とともに半透明のまま並列したガラスカバースリップで安定した、アクセス可能な、間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ(TSCW)を調製する方法を示しています。このTSCWの準備ははるかに免疫学的に不活性薄く開いて開頭術または反復頭蓋骨よりミクログリアの活性化に関してであり、数週間の期間中にイメージングセッションの任意の数を可能にします。我々は、軟膜表面下≤150μmまで増強緑色蛍光蛋白質とミクログリアを視覚化するCX 3 CR 1 GFP / +マウス4でTSCWを準備。我々はまた、この準備が耐久性のあるmicrogliosisを誘導できるTSCW、隣接するタットHIV – 1の神経毒性タンパク質、の定位脳の注射と組み合わせて使用することができることを示している。したがって、この方法では、HIV関連の神経認知障害(HAND)とneuroinflammatoryコンポーネントと他の神経変性疾患のモデルで生きている脳内の時間をかけてミクログリアの形態と運動性の変化を調べるために非常に便利です。
HIV – 1関連神経認知障害(HAND)の実際の基板はおそらくHIV – 1感染単核食細胞から放出される炎症促進性メディエーターによって引き起こされるシナプスアーキテクチャの破壊、であることがコンセンサスがある。ミクログリアの活性化、多核巨細胞、およびアストロサイトの肥大に起因する神経膠症は中枢神経系7のHIV – 1感染及び炎症の非特異的な特徴とみなされます。対照的に、殺す前に起こった神経疾患の重症度は、シナプスの複雑さの損失だけでなく、CNS 8,9,10,11のマクロファージ負担と相関している。しかし、ミクログリア、末梢浸潤マクロファージ、およびHAND患者におけるニューロン間の動的相互作用は、単に従来の免疫細胞化学的研究から得られた従来の静的な処理を用いてモデル化することはできません。我々の研究室から最近の研究では、末梢および中枢単核細胞とニューロン間のこれらの相互作用の少なくとも一部は脳実質(呂、マーカー、Tremblayさん、にHIV – 1タンパク質タット1から72までの定位注射によって部分的にモデル化できることが示唆されている気、およびGelbard、未発表データ)。したがってneuroAIDSため扱いやすい小型の動物モデルにおいて、単球由来のマクロファージ、脳の常駐ミクログリアとニューロン間の相互作用を調べるためにin vivoで二光子イメージングに適用することを決めた。オープン頭蓋骨や間伐、頭蓋骨の準備は時間の短い期間(時間)のための皮質構造の単一の検査をできる一方で、亜急性のイベントのタイムコースに興味がある研究者は、人為的原因の外科的処置にミクログリア/マクロファージを活性化することなく、これらの製剤を使用することはできません。頭蓋冠のウィンドウ。ここでは、接着TSCWで回生から頭蓋冠を防ぐだけでなく、≥3週間のための半透明性を維持する間伐頭蓋骨の領域の上にガラスのカバースリップの小片で、これらの制限を回避する簡単な方法を示しています。我々はさらにこの技術は、私たちは(CX 3 CR 1 / GFPのためのヘテロ接合体マウスの大脳皮質におけるHIVタット1から72までの定位注射に反応して脳微小血管系だけでなく、脳常駐ミクログリアを入力する末梢単球の挙動を監視することができることを示している単核球系統の細胞を同定する)。このテクニックは、簡単に異なる遺伝的背景を持つマウスで使用するために適応させることができ、例えば、我々は日常的にヘテロCX 3 CR 1 / GFPを使用してX汝- 1単球由来のマクロファージ、脳の常駐ミクログリアとニューロン間の相互作用を調査するためにYFP 12匹のマウスHANDに関連する神経炎症の in vivoモデルインチ私たちのTSCWの準備は、研究者が周囲と動物が繰り返し実験的治療の前後に撮像することのできる数週間の期間、以上発生する可能性のある中枢神経系との間の細胞間相互作用を研究することができます。このように、各動物には独自のコントロールとして機能することができます。このTSCWモデルの一つの注意点は調査中の標的細胞は、どちらか遺伝的に強化された蛍光タンパク質(eXFP)を発現したり、頭蓋冠の機械的な違反せずに蛍光色素で標識される設計でなければならないということであり、そのeXFPの式は、十分に堅牢でなければなりません細胞構造は数週間の期間にわたって繰り返さイメージングセッションの後に視覚化することができます。
The authors have nothing to disclose.
我々は、ヘッドプレートのデザインのためにエミリーA.ケリーに感謝。
我々は、HAGにNIHの賞のサポートに感謝しています:PO1 MH64570、RO1 MH56838、RO1 MH078989、R21 MH03851とこの仕事は不可能だったでしょうこれなしジェフリーWaasdorp小児神経学基金の寛大なサポート。 AKMは、NIH(EY019277)、ホワイトホール財団、アルフレッドP.スローン財団とバローズウェルカム基金から医歯薬学総合研究でのキャリア賞によって運営されている。 METは、フォンデラ凝ったエンサンテケベック(FRSQ)ポスドクトレーニングの賞によって運営されている。 DFMは、NIH T32 GM07356およびT32 AI049815によって資金を供給、医療科学者養成プログラムの研修生です。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |