Мы опишем метод неоднократно визуализации мышиной микроглии и циркулирующие моноциты<em> В естественных условиях</em> В течение часов, дней или недель, используя транскраниальная двухфотонной микроскопии. Мы демонстрируем, как готовить в разреженных черепа окно, в котором прерывистого наблюдения покоя микроглии, которые могут быть активированы смежных инъекции стереотаксической от ВИЧ-1 регуляторный белок Tat.
Традиционно в области неврологии, в естественных условиях двухфотонного изображений мышиной центральной нервной системы или связаны с использованием открытого черепа 1,2 или разбавленной-череп 3 препарата. Хотя открытого черепа техника является очень гибким, оно не является оптимальным для изучения микроглии, потому что это инвазивный и может привести к активации микроглии. Хотя в разреженных черепа подход минимально инвазивных, повторяется заново истончение черепа, необходимых для хронических изображений увеличивает риск повреждения тканей и активации микроглии и позволяет ограниченное число изображений сессий. Здесь мы представляем хронических тонкие черепа окна метод мониторинга мышиной микроглии в естественных условиях в течение длительного периода времени с помощью двух-фотонного микроскопа. Мы демонстрируем, как подготовить стабильной, доступной, в разреженных черепа корковых окна (TSCW) с соединенный стекло покровное, что остается полупрозрачной в течение трех недель периодического наблюдения. Этот препарат TSCW гораздо более иммунологически инертен по отношению к активации микроглии, чем открытые краниотомии или повторные черепа прореживания и позволяет произвольным количеством изображений сессий в течение периода времени недель. Мы готовим TSCW в CX 3 CR 1 GFP / + мышей 4 визуализировать микроглии с повышенной зеленый флуоресцентный белок до ≤ 150 мкм под мягкой мозговой оболочки поверхности. Мы также показываем, что этот препарат может быть использован в сочетании с стереотаксической инъекции мозг ВИЧ-1 нейротоксическое белок Tat, прилегающих к TSCW, который способен вызывать прочный microgliosis. Поэтому этот метод является чрезвычайно полезным для изучения изменений в микроглии морфологии и подвижности с течением времени в живой мозг в моделях ВИЧ-ассоциированного Нейрокогнитивная расстройство (РУК) и других нейродегенеративных заболеваний с neuroinflammatory компонента.
Существует растущий консенсус, что фактический субстрат для ВИЧ-1-ассоциированные нейрокогнитивный дефицит (РУК) является разрушение синаптических архитектуры, предположительно вызванной провоспалительных медиаторов освобожден от инфицированных ВИЧ-1 мононуклеарных фагоцитов. Микроглии активации, многоядерные гигантские клетки, а из-за глиоз астроцитарных гипертрофии считаются неспецифические признаки ВИЧ-1 инфекции и воспаления в центральной нервной системе 7. В отличие от тяжести заболевания предсмертном периоде неврологические было связано с потерей синаптических сложности, а также макрофагов бремя в ЦНС 8,9,10,11. Тем не менее, динамическое взаимодействие между микроглии, периферической проникновения макрофагов и нейронов у пациентов с рук просто не могут быть смоделированы с использованием обычных статических обработки полученных из обычных иммуноцитохимического исследований. Последние исследования, проведенные в нашей лаборатории показали, что по крайней мере некоторые из этих взаимодействий между периферической и центральной мононуклеарных клеток и нейронов могут быть смоделированы при частичной стереотаксической инъекции ВИЧ-1 белок Tat 1-72 в паренхимы мозга (Lu, Маркер, Трамбле, Ци, и Гелбард, неопубликованные данные). Поэтому мы решили применить в естественных два изображения фотонов для изучения взаимодействия между моноцитарных макрофаги микроглии мозга резидентом и нейронов, в послушный маленькая модель животного для neuroAIDS. Хотя открытого черепа или в разреженных черепа подготовки позволить себе единый экзамен корковых архитектуры в течение короткого периода времени (часы), следователи заинтересованы в ход времени подострого события не могут использовать эти препараты без artifactually активации микроглии / макрофагов в связи с хирургической манипуляции свода окна. Здесь мы показываем, простой способ обойти это ограничение путем склеивания крошечный кусочек стекла покровного более разбавленной череп области предотвращения свода черепа с регенерирующим в TSCW а также поддержания прозрачности в течение ≥ 3 недель. Кроме того, мы показали, что этот метод позволяет нам контролировать поведение моноцитов в периферической ввода церебрального микроциркуляторного русла, а также мозг-нерезидентов микроглии в ответ на стереотаксической инъекции ВИЧ Тат 1-72 в коре головного мозга мышей гетерозиготных по CX 3 CR 1 / GFP ( выявить клетки мононуклеарных линии). Этот метод может быть легко адаптирована для использования на мышах с различными генетическими фона, например, мы обычно используем гетерозиготных CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 мышей для исследования взаимодействий между моноцитарных макрофаги микроглии мозга резидентом и нейронов в в естественных моделей neuroinflammation отношение к руке. Наши TSCW препарата позволяет исследователям для изучения межклеточных взаимодействий между периферией и ЦНС, которые могут возникнуть в течение периода недели, в котором животное может быть повторно отображаемого до и после экспериментального лечения. Таким образом, каждое животное может служить ее собственным контролем. Одно предостережение для этой модели TSCW в том, что клетки-мишени при расследовании должны быть либо генной инженерии, чтобы выразить расширенной флуоресцентных белков (eXFP) или быть помечены флуоресцентным красителем без механических нарушение свода черепа, и что выражение eXFP должен быть достаточно прочным, чтобы позволяют сотовой архитектурой для визуализации изображений после повторных сеансов в течение нескольких недель.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Эмили А. Келли за дизайн пластин головы.
Мы благодарны за поддержку награды NIH к HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 и щедрой поддержке Джеффри Waasdorp детской неврологии фонда, без которых эта работа не была бы возможна. АКМ финансируется NIH (EY019277), Уайтхолл, Фонд Альфреда П. Слоуна и Карьера премии в области биомедицинских наук от Burroughs Wellcome Фонд. MET финансируется Fonds-де-ла изысканная ан Sante Квебека (FRSQ) докторской награды обучения. DFM является стажером в медицинской программы подготовки ученых, финансируемых NIH T32 и T32 GM07356 AI049815.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |