Vi beskriver en metod för att upprepade gånger visualisera murina mikroglia och cirkulerande monocyter<em> In vivo</em> Över timmar, dagar eller veckor med transkraniell två-photon mikroskopi. Vi visar hur du förbereder en tunnas-skalle fönster som gör återkommande observationer av vilande mikroglia som kan aktiveras genom att intilliggande stereotaktisk injektion av HIV-1 reglerande proteinet Tat.
Traditionellt inom neurovetenskap, in vivo två photon avbildning av murina centrala nervsystemet har antingen involverade användningen av öppna skallen 1,2 eller tunnas-skalle 3 preparat. Medan den öppna-skalle teknik är mycket mångsidig, är det inte optimalt för att studera mikroglia eftersom det är invasiv och kan orsaka microglial aktivering. Även om förtunnas-skallen tillvägagångssätt är minimalt invasiv, upprepade på nytt gallring av skallen som krävs för kronisk avbildning ökar risken för vävnadsskada och microglial aktivering och tillåter ett begränsat antal avbildning sessioner. Här presenterar vi en kronisk tunn skalle fönster metod för övervakning av murina mikroglia in vivo under en längre tid med hjälp av två-photon mikroskopi. Vi visar hur man förbereder ett stabilt, tillgänglig, tunnat-skallen kortikal fönster (TSCW) med en apposed glas täckglas som återstår genomskinliga under loppet av tre veckor intermittent observation. Detta TSCW förberedelser är långt mer immunologiskt inerta med avseende på microglial aktivering än öppen kraniotomi eller upprepad skallen gallring och tillåter ett godtyckligt antal avbildning sessioner under en tidsperiod om veckor. Vi förbereder TSCW i CX 3 sp 1 GFP / + möss 4 att visualisera mikroglia med förbättrade grönt fluorescerande proteinet, ≤ 150 ìm under pial ytan. Vi visar också att denna beredning kan användas tillsammans med stereotaktisk hjärna injektioner av HIV-1 neurotoxiska protein Tat, som gränsar till TSCW, som kan framkalla hållbara microgliosis. Därför är denna metod mycket användbar för att undersöka förändringar i microglial morfologi och motilitet över tiden i den levande hjärnan i modeller av HIV-relaterade neurokognitiva Disorder (HAND) och andra neurodegenerativa sjukdomar med ett neuroinflammatoriska komponent.
Det finns en ökande enighet om att det faktiska underlaget för HIV-1 associerad neurokognitiva brister (HAND) är förstörelse av synaptiska arkitektur, förmodligen orsakad av pro-inflammatoriska mediatorer frigörs från HIV-1 infekterade mononukleära fagocyter. Microglial aktivering, flerkärniga jätteceller och gliosis grund astrocytic hypertrofi anses ospecifik kännetecknar HIV-1 infektion och inflammation i CNS 7. Däremot har svårighetsgrad premortem neurologisk sjukdom varit korrelerad med förlusten av synaptiska komplexitet samt makrofager börda i CNS 8,9,10,11. Men bara dynamiska samspelet mellan mikroglia, perifer infiltrera makrofager och nervceller hos patienter med hand inte kan modelleras med konventionell statisk bearbetning från konventionella immuncytokemiska studier. Färska studier från våra laboratorier har föreslagit att åtminstone några av dessa interaktioner mellan perifera och centrala mononukleära celler och nervceller kan modelleras delvis av stereotaktisk injektion av HIV-1-proteinet Tat 1-72 i hjärnparenkymet (Lu, Marker, Tremblay, Qi, och Gelbard, opublicerade data). Vi beslutade därför att tillämpa in vivo två photon imaging att undersöka samspelet mellan monocyte-derived makrofager, hjärna bosatt mikroglia och nervceller, i en lätthanterlig liten djurmodell för neuroAIDS. Medan öppen skalle eller tunnas-skallen förberedelser råd med en enda undersökning av kortikal arkitektur för en kort tid (timmar), utredare intresserad av tiden under subakut händelser kan inte använda dessa preparat utan artifactually aktivera mikroglia / makrofager grund av kirurgisk manipulation av den calvarial fönstret. Här visar vi ett enkelt sätt att kringgå dessa begränsningar genom att limma en liten glasbit täckglas över förtunnas skallen området hindrar calvarium från regenererande i TSCW samt behålla genomskinlighet i ≥ 3 veckor. Vi visar vidare att denna teknik gör att vi kan bevaka hur de perifera monocyter in cerebral mikrocirkulation samt hjärna hemmahörande mikroglia som svar på stereotaktisk injektion av hiv Tat 1-72 i hjärnbarken hos mus heterozygot för CX 3 CR 1 / GFP ( att identifiera celler av mononukleära härstamning). Denna teknik kan enkelt anpassas till användning på möss med olika genetiska bakgrund, till exempel, vi rutinmässigt använder heterozygot CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 mus för att undersöka interaktioner mellan monocyte-derived makrofager, hjärna mikroglia inhemska och nervceller i in vivo-modeller av neuroinflammation relevant till hands. Vår TSCW förberedelse låter utredare för att studera cell-cell interaktioner mellan periferin och CNS som kan uppstå under perioder om veckor, i vilket djuret kan upprepade gånger avbildas före och efter experimentell behandling. Således kan varje djur fungera som sin egen kontroll. En varning för denna TSCW modell är att målet cellerna under utredning behöver vara antingen genetiskt modifierade att uttrycka förbättrade fluorescerande proteiner (eXFP) eller vara märkta med en fluorescerande färg utan mekaniska brott mot calvarium, och att eXFP uttryck måste vara robust nog att tillåter cellulära arkitektur ska visualiseras efter upprepad avbildning sessioner under en period av veckor.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Emily A. Kelly för huvudet plattan design.
Vi är tacksamma för stödet från NIH utmärkelser till HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 och generöst stöd för Geoffrey Waasdorp neuropediatrik fonden utan vilket detta arbete inte varit möjligt. AKM finansieras av NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Alfred P. Sloan Foundation och en karriär Award i biomedicin från Burroughs Wellcome Fund. MET är finansierad av en Fonds de la recherche en Sante du Quebec (FRSQ) postdoktoral utbildning utmärkelse. DFM är en praktikant i Medical Scientist Training Program, som finansieras av NIH T32 GM07356 och T32 AI049815.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |