يمكن أن تكون على غرار تأثير على وظيفة صلابة الطبقات التحتية الخلوية<em> في المختبر</em> استخدام الهلاميات المائية بولي أكريلاميد متفاوتة التوافق.
Abstract
تصلب الأنسجة عاملا هاما في تحديد وظيفة الخلوية ، وترتبط عادة التغيرات في تصلب الأنسجة مع السرطان ، والتليف الرئوي وأمراض القلب والشرايين 11/01. نهج الخلية البيولوجية التقليدية لدراسة وظيفة الخلوية تنطوي على زراعة الخلايا التحتية الصلبة (الأطباق البلاستيك أو الزجاج coverslips) والتي لا يمكن حساب لتأثير وجود مرونة ECM أو الاختلافات في تصلب الأنسجة بين ECM. لنموذج في الجسم الحي شروط الامتثال الأنسجة في المختبر ، ونحن وآخرون استخدام ECM المغلفة الهلاميات المائية. في مختبرنا ، تستند على بولي أكريلاميد الهلاميات المائية التي يمكن أن تحاكي مجموعة من التوافق الأنسجة البيولوجية المشاهدة 12. يتم إنشاء "رد الفعل" زلات تغطية الحضانة مع هيدروكسيد الصوديوم التي تليها إضافة APTMS – 3. يستخدم غلوتارالدهيد العابرة للربط 3 APTMS وهلام بولي أكريلاميد. يستخدم محلول من مادة الأكريلاميد (ميلان) ، مكررا الأكريلاميد (BIS – AC) وبيرسلفات الأمونيوم للبلمرة من هيدروجيل. أدرج N – hydroxysuccinimide (NHS) في حل التيار المتردد لبروتين ECM تشعبي إلى هيدروجيل. بعد البلمرة لهيدروجيل ، وهي مغلفة سطح هلام مع البروتين ECM اختيار مثل فبرونيكتين الكولاجين ، vitronectin ، الخ.
ويمكن تحديد صلابة من هيدروجيل الريولوجيا أو بواسطة المجهر القوة الذرية (AFM) وتعديلها من خلال تغيير نسبة AC و / أو مكررا AC – 12 في الحل. بهذه الطريقة ، يمكن أن تكون مطابقة صلابة التحتية للتصلب الأنسجة البيولوجية التي يمكن أيضا أن يكون كميا أو باستخدام الريولوجيا فؤاد. ويمكن عندئذ أن تكون خلايا المصنف على هذه الهلاميات المائية وتربيتها على أساس الظروف التجريبية المطلوبة. تصوير الخلايا وشفائهم للتحليل الجزيئي واضح ومباشر. لهذه المقالة ، أن نحدد الطبقات التحتية لينة ومرنة وجود تلك moduli (E) <3000 باسكال والطبقات التحتية تيبس / مثل تلك الأنسجة مع E> 20000 باسكال.
Protocol
إعداد يجب تعقيمها Coverslips. وينبغي استخدام معقم أو منزوع الأيونات الماء المقطر لإعداد الحلول وcoverslips الغسيل. ميلان (40 ٪ W / V) ومكررا – AC (1 ٪ ث / ت) يتم تعقيم الحلول عن طريق…
Discussion
وثمة عنصر حاسم في عملية البلمرة هيدروجيل لتجنب تشكيل فقاعة الهواء التي تسمح الخلايا لربط ساترة الزجاج بدلا من هيدروجيل ECM المغلفة نفسها. ويمكن منع ذلك عن طريق حل pipetting بعناية بعد البلمرة vortexing البصر ، وجعل على يقين من أي فقاعات هواء أصبحت المحاصرين في هلام. كنا دائما ن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
العمل هو معتمد مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة.
Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089, doi:10.3791/2089 (2010).