Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis
Summary
O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser modelados<em> In vitro</em> Usando hidrogéis de poliacrilamida de diferentes conformidades.
Abstract
Rigidez do tecido é um determinante importante da função celular, e mudanças na rigidez do tecido são comumente associados com câncer, fibrose e doenças cardiovasculares 1-11. Abordagens tradicionais de células biológicas para estudar a função celular envolvem a cultura de células em um substrato rígido (pratos de plástico ou de lamínulas de vidro) que não pode explicar o efeito de um ECM elástica ou as variações de ECM rigidez entre os tecidos. O modelo em condições de tecido vivo cumprimento in vitro, nós e os outros usam ECM-revestido hidrogéis. Em nosso laboratório, os hidrogéis são baseados em poliacrilamida, que podem imitar a faixa de tecido conformidades visto biologicamente 12. "Reativa" lamínulas são gerados por incubação com NaOH seguidos pela adição de 3-APTMS. Glutaraldeído é usado para cross-link 3-APTMS eo gel de poliacrilamida. A solução de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) e persulfato de amônio é utilizado para a polimerização do hidrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) é incorporado a solução CA para crosslink proteína ECM para o hidrogel. Após a polimerização do hidrogel, a superfície do gel é revestido com uma proteína de ECM de escolha, tais como a fibronectina, vitronectina colágeno, etc
A rigidez de um hidrogel pode ser determinada por reologia ou microscopia de força atômica (AFM) e ajustado pela variação do percentual de AC e / ou bis-AC na solução 12. Desta forma, a rigidez substrato pode ser combinada com a rigidez dos tecidos biológicos que também pode ser quantificada através de reologia ou AFM. As células podem ser semeados nesses hidrogéis e cultivadas com base nas condições experimentais necessárias. Imagem das células e sua recuperação para a análise molecular é simples. Para este artigo, definimos substratos moles como aqueles que têm módulos elásticos (E) <3000 Pascal e substratos rígidos / tecidos como aqueles com E> 20000 Pascal.
Protocol
Discussion
Um elemento crucial do processo de polimerização hidrogel é evitar a formação de bolhas de ar que vai permitir que as células se ligam à lamela de vidro, em vez de o hidrogel ECM revestido em si. Isto pode ser evitado com cuidado pipetagem a solução de polimerização após vórtex e visualmente para que não se têm bolhas de ar ficam presas no gel. Recomendamos sempre a preparar adicionais "reativa" lamínulas e hidrogéis para garantir ter o suficiente para a experimentação.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho é o nosso laboratório é suportada por concessões do National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
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