Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele
Summary
Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden kann<em> In-vitro-</em> Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher nachzubessern.
Abstract
Tissue Steifigkeit ist eine wichtige Determinante für zelluläre Funktion und Veränderungen im Gewebe Steifigkeit sind häufig mit Fibrose, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankung 1-11 verbunden. Traditionelle zellbiologische Ansätze zum Studium zellulärer Funktionen werden Zellkulturen auf einem starren Substrat (Plastikschalen oder Deckgläschen), die nicht für die Wirkung eines elastischen ECM oder die Variationen in ECM Steifigkeit zwischen Geweben erklären kann. Zur Modellierung in vivo Tissue Compliance-Bedingungen in vitro, verwenden wir und andere ECM-beschichteten Hydrogele. In unserem Labor werden die Hydrogele auf Polyacrylamid, die den Bereich des Tissue Verstöße gesehen biologisch 12 nachahmen kann basieren. "Reaktive" Deckgläser werden durch Inkubation mit NaOH durch Zugabe von 3-APTMS gefolgt generiert. Glutaraldehyd wird verwendet, um Vernetzung der 3-APTMS und das Polyacrylamidgel. Eine Lösung von Acrylamid (AC), Bis-Acrylamid (Bis-AC) und Ammoniumpersulfat ist für die Polymerisation des Hydrogels verwendet. N-Hydroxysuccinimid (NHS) in den AC-Lösung zur Vernetzung von ECM-Protein auf das Hydrogel eingebaut. Nach der Polymerisation des Hydrogels wird das Gel Oberfläche mit einer ECM-Protein der Wahl, wie Fibronektin, Vitronektin, Kollagen, etc. beschichtet
Die Steifigkeit eines Hydrogels kann durch Rheologie oder Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestimmt und angepasst werden durch Variation der Anteil der AC-und / oder Bis-AC in der Lösung 12. Auf diese Weise können Substrat Steifigkeit, um die Steifigkeit von biologischen Geweben, die auch quantifiziert werden mit Hilfe der Rheologie oder AFM abgestimmt werden. Die Zellen können dann auf dieser Hydrogele und kultiviert auf die experimentellen Voraussetzungen basiert ausgesät werden. Imaging der Zellen und ihre Genesung für die molekulare Analyse ist einfach. Für diesen Artikel definieren wir weichen Substraten, wie solche mit Elastizitätsmoduln (E) <3000 Pascal und steife Substrate / Gewebe wie die mit E> 20.000 Pascal.
Protocol
Discussion
Ein entscheidendes Element des Hydrogels Polymerisation wird die Luft Blasenbildung, die es Zellen, die Deckglas, anstatt die ECM-beschichteten Hydrogel sich binden zu vermeiden. Dies kann durch vorsichtiges Pipettieren der Polymerisationslösung nach Vortexen und visuell darauf achten, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden in das Gel verhindert werden. Wir empfehlen immer, bereitet zusätzliche "reaktiven" Deckgläser und Hydrogele, um sicherzustellen, dass genug für Experimente.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit ist unser Labor durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
