El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser modelada<em> In vitro</em> Utilizando los hidrogeles de poliacrilamida de diferentes incumplimientos.
La rigidez del tejido es un factor determinante de la función celular, y cambios en la rigidez del tejido son comúnmente asociados con la fibrosis, cáncer y enfermedades cardiovasculares 1-11. Los enfoques tradicionales de biología celular al estudio de la función celular implica el cultivo de células sobre un sustrato rígido (platos de plástico o de vidrio cubreobjetos), que no puede explicar el efecto de una ECM elástica o las variaciones en la rigidez de ECM entre los tejidos. Para crear un modelo in vivo las condiciones del tejido cumplimiento in vitro, y otros utilizan ECM-revestidos hidrogeles. En nuestro laboratorio, los hidrogeles se basan en la poliacrilamida que puede imitar la serie de incumplimientos del tejido biológico visto 12. "Reactiva" cubreobjetos son generados por la incubación con NaOH seguido por la adición de 3-APTMS. El glutaraldehído se utiliza para reticular el 3-APTMS y el gel de poliacrilamida. Una solución de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) y persulfato de amonio se utiliza para la polimerización del hidrogel. N-hidroxisuccinimida (NHS) se incorpora a la solución de CA para reticular las proteínas ECM al hidrogel. Después de la polimerización del hidrogel, la superficie del gel está recubierto con una proteína de elección ECM como la fibronectina, vitronectina, colágeno, etc
La rigidez de un hidrogel puede ser determinada por la reología o microscopía de fuerza atómica (AFM) y ajustado variando el porcentaje de AC y / o AC-bis en la solución 12. De esta manera, la rigidez sustrato se puede adaptar a la rigidez de los tejidos biológicos, que también puede ser cuantificado usando la reología o AFM. Células pueden ser sembradas en estos hidrogeles y cultivadas según las condiciones experimentales necesarias. Imágenes de las células y su recuperación para el análisis molecular es sencillo. Para este artículo, se define sustratos blandos como los que tienen módulos de elasticidad (E) <3000 Pascal y sustratos rígidos / tejidos como aquellos con E> 20.000 Pascal.
Un elemento crucial del proceso de polimerización de hidrogel es para evitar la formación de burbujas de aire que permiten que las células se unen a la cubreobjetos de vidrio en lugar de que el hidrogel ECM-revestidos en sí. Esto se puede evitar con cuidado pipeteando la solución de polimerización después de agitación y visual asegurándose que no queden burbujas de aire han quedado atrapados en el gel. Nosotros siempre recomendamos la preparación adicional "reactivo" cubreobjetos y los hidrogeles par…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo es nuestro laboratorio es apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |