Summary
Na blootstelling aan antigeen, subpopulaties van geactiveerde B-cellen worden onderworpen aan een proces dat bekend staat als klasse switch recombinatie (CSR) van antilichamen isotypen te produceren met verschillende effector functies. Het protocol beschreven in dit rapport legt uit hoe MVO kan worden opgewekt en geanalyseerd
Abstract
Humorale immuniteit is de tak van het immuunsysteem onderhouden door B-cellen en gemedieerd door de secretie van antilichamen. Bij de B-cel activatie, de immunoglobuline locus ondergaat een reeks van genetische modificaties te veranderen het bindend vermogen en effector functie van de uitgescheiden antilichamen. Dit proces wordt benadrukt door een genomische recombinatie gebeurtenis bekend als klasse switch recombinatie (CSR), waarin de standaard IgM-antilichaam isotype is vervangen door een van de IgG, IgA of IgE. Elke isotype beschikt over verschillende effector functies waardoor MVO cruciaal voor het behoud van de immuniteit.
Diversificatie van de immunoglobuline locus wordt gemedieerd door het enzym activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID). Een schematische video beschrijft dit proces in detail is online beschikbaar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID activiteit en het MVO-pad worden over het algemeen bestudeerd in de beoordeling van de B-cel functie en humorale immuniteit bij muizen. Het protocol beschreven in dit rapport presenteert een methode van B-cel isolatie van murine milt en de daaropvolgende stimulatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) te bewegen klasse overschakelen naar IgG3 (voor andere antilichaam isotypes zie tabel 1). Daarnaast is de fluorescente kleurstof cel vlekken carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gebruikt om de celdeling van de gestimuleerde cellen, een proces dat van cruciaal belang om over te stappen 1, 2 isotype monitor.
De regulering van de AID en het mechanisme waarmee MVO gebeurt nog steeds onduidelijk en dus in-vitro-klasse switch testen leveren een betrouwbare methode voor het testen van deze processen in verschillende muismodellen. Deze testen zijn eerder gebruikt in de context van gen-deficiëntie gebruik van knock-out muizen 3. Bovendien kan in vitro schakelen van B-cellen worden voorafgegaan door virale transductie voor het moduleren van genexpressie door RNA knockdown of transgenexpressie 4-6. De gegevens van dit soort experimenten hebben beïnvloed ons begrip van de AID activiteit, resolutie van de MVO-reactie, en antilichaam-gemedieerde immuniteit in de muis.
Protocol
Stap I: Isolatie van milt B-cellen via magnetische verrijking
- Experimentele muizen moet worden leeftijd van 8-12 weken op volle rijping van het immuunsysteem te verzekeren.
- Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en genieten in 70% ethanol. Chirurgisch te verwijderen van de milt door het maken van een incisie door de huid en spieren van de linker hypochondrium van de buik en snijd het in drie grote stukken in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorg ervoor dat alle instrumenten en reagentia steriel zijn.
- Met behulp van de rubber einde van een 1 ml zuiger, de milt zachtjes beslag door een 70 um cel zeef in PBS. Zorg ervoor dat u een duwende beweging in plaats van een vermalen beweging te gebruiken als slijpen kan leiden tot scheuren van grotere (dwz prolifererende) cellen.
- Spin down de cellen op niet meer dan 350 g gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in PBS. Tel de geresuspendeerd cellen met behulp van een hemocytometer.
- Maak een suspensie van 1x10 8 cellen / ml in PBS met 5% normaal serum rat in een steriele 5 mL polystyreen buis met een kap (maximaal volume van 2 ml per buis).
- Voeg 50 ul van EasySep negatieve selectie Mouse B Cell Enrichment cocktail voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 15 minuten.
- Voeg 100 ul EasySep Biotine Selectie Cocktail voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 15 minuten.
- Voeg 100 ul van EasySep magnetische nanodeeltjes (zorgen voor nanodeeltjes worden goed gemengd en de oplossing homogeen is) voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 5 minuten.
- Top de oplossing voor 2,5 ml met PBS en plaats het in een EasySep magneet voor 5 minuten. Omkeren van de magneet en buis en giet al snel in een nieuwe polystyreen buis. Schud de buis als negatief geselecteerde cellen zullen magnetisch gebonden zijn aan de buis muren.
- Verder te verhogen de zuiverheid van de celsuspensie, kan de buis worden opnieuw in de magneet voor een extra 5 minuten en gegoten in een nieuwe buis. Dit kan verminderen de totale cel herstel.
- B-cel zuiverheid kan worden beoordeeld door flowcytometrische analyse van het B-cel oppervlakte markers. Na de verrijking, we voortdurend zien met een zuiverheid van> 95% B220 positieve cellen.
Stap II: CFSE cel verkleuring
- Resuspendeer de geïsoleerde cellen in warme PBS aangevuld met 0,1% bovine serum albumine bij een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 6 cellen per ml.
- Bereid een 5mm voorraad oplossing van CFSE (verdund in steriele dimethylsulfoxide) en voeg 2μL voor elke mL van cellen in de buis. De uiteindelijke concentratie van 10μM is optimaal voor de kleuring van primaire B-cellen.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten in het donker (let op: CFSE is lichtgevoelig en moet in het donker bewaard indien mogelijk zijn).
- Quench de vlek door het toevoegen van een gelijk volume van runderen kalfsserum naar uw cellen en incuberen op ijs gedurende 5 minuten.
- Was de cellen door bijvullen van de buizen met kweekmedium (zie stap III voor recept) en centrifugeren bij 350 g. Merk op dat ten minste 5 keer het volume equivalent van media moet worden toegevoegd om de viscositeit van de runder-kalf serum tegen te gaan en voor de cellen om een pellet te produceren.
- Was de cellen twee keer meer in cultuur medium. De cellen zijn nu klaar voor stimulatie.
Stap III: cel stimulatie met LPS
- Bereid uw in-vitro-B celkweekmedium te vullen RPMI 1640 met 10% foetaal kalf serum en 50 uM β-mercapto-ethanol /.
- Bereid uw stimulatie medium door het toevoegen van LPS op een uiteindelijke concentratie van 50μg/mL. Aliquot 125 pi van de stimulatie medium in elk putje van een vlakke bodem met 96 putjes weefselkweek plaat.
- Bereid uw CFSE-gekleurde B-cellen in kweekmedium zonder LPS bij een uiteindelijke concentratie van 3,2 x 10 6 cellen / ml. Voeg 125 pi van de celsuspensie aan de wells met uw stimulatie medium en meng door pipetteren voorzichtig.
- Elk putje bevat nu 4 x 10 5 cellen in een uiteindelijke LPS concentratie van 25 ug / ml. Dit zorgt voor een optimaal niveau van de celproliferatie en klasse schakelen, maar wijzigingen in deze waarden kunnen worden gedaan zoals gewenst.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 72 tot 96 uur. Na 48 uur zal clusters van grote prolifererende B-cellen zijn duidelijk zichtbaar onder een microscoop.
Stap IV: Flowcytometrische analyse van klasse wisselen
- Als u klaar bent om naar te kijken class switching, verwijder je cellen uit hun kweekomstandigheden en twee keer was ze in 1 ml vlekken buffer (PBS met 2% boviene kalfsserum).
- Om niet-specifieke antilichaam kleuring van je cellen, pellet de cellen te voorkomen dat door het draaien van hen neer op 350 g en incute ze in 100μL van verkleuring buffer met 5% normale muis serum en 1μg van FcBlock per106 cellen gedurende 15 minuten op ijs. Cel blokkeren moet worden uitgevoerd op het ijs.
- Zonder het wassen van je cellen, voeg 1μg per 10 6 cellen van een fluorescent gelabelde anti-muis antilichaam IgG3 en laat de cellen vlek gedurende 30 minuten op ijs.
- Twee keer wassen van de cellen door centrifugeren en resuspendeer in 200-300 ul vlekken buffer. De cellen zijn nu klaar voor beoordeling door flowcytometrie.
- CFSE is optimaal enthousiast bij 492 nm (door een argon-ion laser) en stoot op 517 nm. De excitatie-en emissiespectrum van de IgG3 antilichaam is afhankelijk van zijn geconjugeerde fluorescente kleurstof.
Representatieve resultaten
Na de magnetische verrijking, moet de celsuspensie eruit als een homogene populatie van niet te onderscheiden kleine ronde cellen (Figuur 1A). Na 48-72 uur van de stimulatie, zal geïsoleerde clusters van vergrote prolifererende cellen zijn duidelijk zichtbaar (figuur 1B). Een groot deel van de niet-prolifererende cellen zal verschijnen klein en korrelig als ze ondergaan apoptose.
MVO kan normaal gesproken worden gedetecteerd op het hoogste niveau tussen de 72 en 96 uur na stimulatie voor het grootste deel van de cellen beginnen te sterven 7. In dit stadium, moeten de cellen hebben ondergaan een aantal celdelingen met geschakelde cellen die in de latere dochter celpopulatie. Een vertegenwoordiger flowcytometrische perceel van CFSE verdunning en oppervlakte-expressie van IgG3 na 96 uur van LPS stimulatie is te zien in figuur 2.
Tabel 1. Isotype schakelen cocktails. Let op: Stimulant concentraties zijn slechts aanbevelingen. Titraties kan nodig zijn.
| Gewenste Isotype | Stimulatie Cocktail |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) en IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) en IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) en IFN-γ (10 ng / mL) |
| IgG2b en IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) en IL-5 (1.5 ng / mL) |
Figuur 1. Isolatie en LPS stimulatie van milt B-cellen. (A) Magnetisch verrijkt milt B-cellen voor de LPS stimulatie. (B) 48 uur na stimulatie met 25 ug / ml LPS. Woekerende cellen worden gezien als clusters in een achtergrond van straal-en apoptotische cellen.
Figuur 2. Proliferatie en klasse switch recombinatie na 96 uur. (A) CFSE verwatering voor LPS gestimuleerde cellen na 96 uur in cultuur. Iedere onafhankelijke piek vertegenwoordigt een verwatering van de CFSE fluorescentie die overeenkomt met een onafhankelijke celdeling. (B) IgG3 uitdrukking met de opkomst van een IgG3 positieve populatie na verscheidene rondes van celdeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hierboven geschetste biedt een standaard test om AID expressie en functie analyseert tijdens de les schakelen van de primaire muizen B-cellen. Dit protocol maakt gebruik van bacteriële LPS te induceren schakelen van IgM naar IgG3, maar aanpassingen aan de stimulatie media kan worden gemaakt om te bewegen te schakelen naar andere isotypen (samengevat in Tabel 1 8, 9).
We hebben opgemerkt dat, voor nog onbekende redenen, foetaal kalf serum kan het niveau van de klasse te schakelen in vitro waargenomen beïnvloeden. Het is cruciaal dat hetzelfde lotnummer worden gebruikt voor alle MVO-experimenten om experimentele consistentie te waarborgen. Het kan ook nuttig zijn om een panel van foetaal kalf serum bronnen om een optimale te bereiken in vitro overstappercentages scherm. Muizenstammen kunnen ook invloed hebben op de mate van klasse wisselen gezien in vitro 10. Afhankelijk van de test in kwestie, slecht schakelen muriene modellen, zoals de SJL muis, moet voldoende worden teruggekruist aan de C57BL / 6 achtergrond geen noemenswaardige overstappercentages bereiken.
Ik stap kan worden weggelaten als een pure B-cel cultuur is niet gewenst. Het stimuleren van een mengsel van milt cellen zal nog leiden tot klasse schakelen, hoewel het kan leiden tot een grotere populatie van apoptotische non-B-cellen. Bovendien moeten de volgende flowcytometrische analyse onder andere een gevestigde B-cel marker (bijv. B220, CD19). De zuivering kit die in dit protocol wordt geleverd door StemCell Technologies (zie reagentia tabel). Alternatieve kits die een negatieve verrijkingsproces gebruik kan ook worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.
CFSE fluorescentie kan heel intens zijn en dus elk experiment moet een passende vergoeding controle voor flowcytometrische analyse. Daarnaast zal CFSE langzaam uit lekken van cellen resulteert in een vermindering van de totale fluorescentie in de tijd. Om deze redenen wordt aanbevolen dat alle proeven een ongestimuleerde CFSE-gekleurde cel populatie omvatten. Over een korte periode van tijd, zullen deze cellen blijven statisch in cultuur en kan dus gebruikt worden als een compensatie voor de controle CFSE en de niet-prolifererende celpopulatie te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de Martin laboratorium voor nuttige discussies. Deze publicatie wordt ondersteund door een subsidie van het Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM wordt ondersteund door een Canada Research Chair Tier II Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
