Summary
प्रतिजन जोखिम के बाद, सक्रिय बी कोशिकाओं के उप - जनसंख्या एक वर्ग स्विच पुनर्संयोजन (सीएसआर) के रूप में जाना जाता है के लिए विशिष्ट effector कार्यों के साथ एंटीबॉडी isotypes का उत्पादन प्रक्रिया से गुजरना. इस रिपोर्ट में उल्लिखित प्रोटोकॉल बताते हैं कि कैसे सीएसआर और प्रेरित किया जा सकता है विश्लेषण
Abstract
Humoral रोगक्षमता बी कोशिकाओं द्वारा बनाए रखा है और एंटीबॉडी के स्राव के माध्यम से मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रणाली की शाखा है. बी सेल सक्रियण पर, immunoglobulin ठिकाना बाध्यकारी क्षमता और secreted एंटीबॉडी के effector समारोह में परिवर्तन करने के लिए आनुवंशिक संशोधनों की एक श्रृंखला आए. यह प्रक्रिया एक जीनोमिक पुनर्संयोजन वर्ग स्विच (सीएसआर) पुनर्संयोजन जिसमें डिफ़ॉल्ट आईजीएम एंटीबॉडी निर्धारण आईजीजी, IgA, या IgE के लिए एवजी है के रूप में जाना जाता घटना से प्रकाश डाला है. प्रत्येक निर्धारण अलग effector जिससे सीएसआर उन्मुक्ति के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण बनाने के कार्यों के पास.
Immunoglobulin बिन्दुपथ के विविधीकरण एंजाइम सक्रियण प्रेरित cytidine deaminase (सहायता) द्वारा मध्यस्थता है. विस्तार से इस प्रक्रिया का वर्णन एक योजनाबद्ध वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html) है. सहायता की गतिविधि और सीएसआर मार्ग आमतौर पर बी सेल समारोह और चूहों में humoral रोगक्षमता के मूल्यांकन में अध्ययन कर रहे हैं. इस रिपोर्ट में उल्लिखित प्रोटोकॉल murine spleens और जीवाणु (LPS) lipopolysaccharide वर्ग IgG3 करने के लिए स्विचन (अन्य एंटीबॉडी isotypes के लिए एक टेबल देखें) प्रेरित के साथ बाद में उत्तेजना से बी सेल अलगाव की एक विधि प्रस्तुत करता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट सेल धुंधला डाई Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) प्रेरित कोशिकाओं के कोशिका विभाजन, एक करने के लिए स्विचन 1, 2 निर्धारण महत्वपूर्ण प्रक्रिया की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है.
सहायता के नियमन और व्यवस्था है जिसके द्वारा सीएसआर होता है अभी भी स्पष्ट नहीं है और इस प्रकार इन विट्रो वर्ग स्विच assays में विभिन्न माउस मॉडल में इन प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं. ये assays के पहले जीन का उपयोग कर पीटा 3 चूहों की कमी के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया है . इसके अलावा, इन विट्रो बी कोशिकाओं की स्विचन में वायरल पारगमन द्वारा पहले किया जा सकता है आरएनए पछाड़ना या transgene अभिव्यक्ति 4-6 से जीन अभिव्यक्ति न्यूनाधिक . प्रयोगों के इन प्रकार से डेटा सहायता गतिविधि, सीएसआर प्रतिक्रिया का संकल्प, और माउस में प्रतिरक्षा एंटीबॉडी की मध्यस्थता की हमारी समझ को प्रभावित किया है.
Protocol
मैं चरण: प्लीहा - संबंधी बी कोशिकाओं के चुंबकीय संवर्धन के माध्यम से अलगाव
- प्रायोगिक चूहों 8-12 सप्ताह आयु वर्ग किया जाना चाहिए करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के पूर्ण परिपक्वता सुनिश्चित.
- गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था द्वारा माउस euthanize और 70% इथेनॉल में लेना. शल्य चिकित्सा त्वचा और पेट के बाईं hypochondrium की मांसपेशियों के माध्यम से एक चीरा द्वारा तिल्ली हटा दें और इसे फॉस्फेट में तीन बड़े टुकड़ों में काट खारा buffered (पीबीएस). सभी उपकरणों और अभिकर्मकों बाँझ हैं सुनिश्चित करें.
- 1 एमएल सिरिंज सवार रबर अंत का प्रयोग, धीरे से मैश पीबीएस में 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से तिल्ली. एक धक्का के बजाय एक पीस को गति गति का उपयोग के रूप में पीस बड़ा कोशिकाओं (अर्थात् proliferating) का टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सुनिश्चित करें.
- नीचे 5 मिनट के लिए 350 से अधिक नहीं जी कोशिकाओं घुमाओ और पीबीएस में गोली resuspend. Resuspended एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
- 5% एक टोपी के साथ एक बाँझ 5 एमएल polystyrene ट्यूब में सामान्य चूहा सीरम (2 एमएल प्रति ट्यूब की अधिकतम मात्रा) के साथ 1x10 8 कोशिकाओं / पीबीएस में एमएल के निलंबन की तैयारी .
- EasySep नकारात्मक चयन माउस कोशिकाओं के हर एमएल के लिए बी सेल संवर्धन कॉकटेल के 50 μL जोड़ें. मिश्रण पिपेट, ट्यूब, टोपी और 15 मिनट के लिए फ्रिज में जगह है.
- कक्षों की हर एमएल के लिए 100 μL EasySep बायोटिन चयन कॉकटेल जोड़ें. मिश्रण पिपेट, ट्यूब, टोपी और 15 मिनट के लिए फ्रिज में जगह है.
- कक्षों की हर एमएल के लिए EasySep मेगनेटिक नैनोकणों के 100 μL (सुनिश्चित नैनोकणों अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं और समाधान समरूप है) जोड़ें. मिश्रण पिपेट, ट्यूब, टोपी और 5 मिनट के लिए फ्रिज में जगह है.
- पीबीएस और 5 मिनट के लिए एक EasySep चुंबक में स्थान के साथ शीर्ष 2.5ml का हल. चुंबक और ट्यूब उलटें और जल्दी से एक नया polystyrene ट्यूब में डाल. ट्यूब हिला के रूप में नकारात्मक चयनित कक्षों चुंबकीय ट्यूब दीवारों को बाध्य होंगे मत करो.
- आगे सेल निलंबन की शुद्धता बढ़ाने के, ट्यूब एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए चुंबक में reinserted हो सकता है और एक नया ट्यूब में डाल दिया. यह समग्र सेल वसूली को कम कर सकते हैं.
- बी सेल शुद्धता बी कोशिका की सतह मार्करों के प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. संवर्धन के बाद, हम लगातार> B220 सकारात्मक कोशिकाओं 95% की एक पवित्रता देखें.
द्वितीय चरण CFSE सेल धुंधला:
- गर्म पीबीएस अलग कक्षों में 1 एक्स 10 एमएल प्रति 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता में 0.1% गोजातीय albumin सीरम के साथ पूरक Resuspend.
- CFSE (बाँझ डाइमिथाइल sulfoxide में पतला) की एक 5mm शेयर समाधान तैयार है और ट्यूब में कोशिकाओं के हर एमएल के लिए 2μL जोड़ें. 10μM के अंतिम एकाग्रता प्राथमिक बी कोशिकाओं का धुंधला के लिए इष्टतम है.
- 37 में सेते ° सी अंधेरे में 10 मिनट के लिए (ध्यान दें: CFSE प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और जब संभव अंधेरे में रखा जाना चाहिए).
- अपनी कोशिकाओं को गोजातीय बछड़ा सीरम की एक बराबर मात्रा जोड़ने और 5 मिनट के लिए बर्फ पर incubating दाग बुझाने.
- मध्यम संस्कृति के साथ ट्यूबों टॉपिंग (नुस्खा के लिए कदम क्ष्क्ष्क्ष्) और 350 पर centrifuging जी द्वारा कोशिकाओं धो नोट करें कि कम से कम 5 बार मीडिया की मात्रा बराबर गोजातीय बछड़ा सीरम का चिपचिपापन प्रतिक्रिया और कोशिकाओं के लिए एक गोली का उत्पादन करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
- संस्कृति के माध्यम में दो बार अधिक कक्षों धो लें. कोशिकाओं को अब उत्तेजना के लिए तैयार हैं.
चरण III के: LPS के साथ सेल उत्तेजना
- इन विट्रो बी सेल संस्कृति माध्यम में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 50 सुक्ष्ममापी β mercaptoethanol / 1640 RPMI सप्लीमेंट द्वारा तैयार.
- अपनी उत्तेजना मध्यम 50μg/mL की अंतिम एकाग्रता में LPS जोड़कर तैयार करें. विभाज्य एक फ्लैट नीचे के प्रत्येक 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में 125 उत्तेजना मध्यम μL.
- 3.2 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के अंतिम एकाग्रता में LPS के बिना संस्कृति के माध्यम में अपने CFSE सना हुआ बी कोशिकाओं की तैयारी. अपने उत्तेजना मध्यम और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण युक्त कुओं को सेल निलंबन के 125 μL जोड़ें.
- हर अच्छी तरह से अब 25 μg / एमएल के एक अंतिम LPS एकाग्रता में 4 x 10 5 कोशिकाओं शामिल है . यह सेल प्रसार और वर्ग स्विचन का इष्टतम स्तर प्रदान करता है, हालांकि इन मूल्यों के परिवर्तन किया जा के रूप में वांछित हो सकता है.
- 37 में कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 72 करने के लिए 96 घंटे के लिए सीओ 2 . 48 घंटे के बाद, बड़े proliferating बी कोशिकाओं के समूहों को स्पष्ट रूप से एक खुर्दबीन के नीचे दिखाई जाएगी.
चरण चतुर्थ वर्ग स्विचन के प्रवाह cytometric विश्लेषण:
- जब आप वर्ग स्विचन पर देखने के लिए तैयार हैं, उनकी संस्कृति की स्थिति से अपने कोशिकाओं को हटाने और उन्हें धुंधला बफर (2% गोजातीय बछड़ा सीरम के साथ पीबीएस) की 1 एमएल में दो बार धोने.
- उन्हें 350 ग्राम और incuba नीचे कताई द्वारा अपने कोशिकाओं, गोली कोशिकाओं की गैर विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला को रोकनेउन्हें 5% FcBlock बर्फ पर 15 मिनट के लिए per106 कोशिकाओं की सामान्य माउस सीरम और 1μg के साथ बफर धुंधला के 100μL में ते. सेल अवरुद्ध बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
- अपनी कोशिकाओं धोने के बिना, 1μg 10 fluorescently टैग विरोधी माउस IgG3 एंटीबॉडी के 6 कोशिकाओं प्रति जोड़ सकते हैं और कोशिकाओं को बर्फ पर 30 मिनट के लिए दाग करने के लिए अनुमति देते हैं.
- और धुंधला बफर के 200-300 μL में centrifugation resuspend द्वारा कोशिकाओं को दो बार धो. कोशिकाओं को अब कर रहे हैं प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन के लिए तैयार है.
- CFSE 492 एनएम पर बेहतर उत्साहित है (एक आर्गन आयन लेजर द्वारा) और 517 एनएम उत्सर्जन करता है. IgG3 एंटीबॉडी की उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम अपनी संयुग्म फ्लोरोसेंट रंजक पर निर्भर है.
प्रतिनिधि परिणाम
चुंबकीय संवर्धन के बाद, सेल निलंबन अप्रभेद्य छोटे परिपत्र कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) की एक समरूप जनसंख्या की तरह दिखना चाहिए. उत्तेजना के 48-72 घंटे के बाद बढ़े proliferating कोशिकाओं के पृथक समूहों को स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकता है (चित्रा 1 बी). गैर proliferating कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा छोटे और बारीक प्रकट रूप में वे apoptosis से गुजरना होगा.
सीएसआर सामान्य रूप से उत्तेजना के बाद 72 और 96 घंटे के बीच उच्चतम स्तर पर पाया जा सकता है कक्षों की सबसे पहले से 7 मरने के लिए शुरू. इस स्तर पर, स्विच बाद बेटी सेल की आबादी में प्रदर्शित होने कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं कोशिका विभाजन के एक नंबर आया है चाहिए. CFSE कमजोर पड़ने और IgG3 LPS उत्तेजना के 96 घंटे के बाद की सतह अभिव्यक्ति का एक प्रतिनिधि प्रवाह cytometric साजिश चित्रा 2 में देखा जा सकता है.
टेबल 1 कॉकटेल स्विचन निर्धारण. नोट: उत्तेजक एकाग्रता मूल्यों सिफारिशें ही कर रहे हैं. Titrations आवश्यक हो सकता है है.
| वांछित निर्धारण | उत्तेजना कॉकटेल |
| IgG1and IgE | (25μg/mL) LPS और आईएल 4 (10 एनजी / एमएल) |
| IgG1and IgE | (10μg/mL) विरोधी CD40 और आईएल 4 (10 एनजी / एमएल) |
| IgG2a | (25μg/mL) LPS और IFN-γ (10 एनजी / एमएल) |
| IgG2b और IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | (25μg/mL) LPS, TGF-बीटा (2 एनजी / एमएल) और आईएल 5 (1.5 एनजी / एमएल) |
चित्रा 1 अलगाव और प्लीहा - संबंधी बी कोशिकाओं के LPS उत्तेजना. (क) चुंबकीय LPS उत्तेजना से पहले प्लीहा - संबंधी बी कोशिकाओं समृद्ध है. (ख) 48 घंटे 25 μg / LPS के एमएल के साथ उत्तेजना के बाद. Proliferating कोशिकाओं को नष्ट और apoptotic कोशिकाओं की पृष्ठभूमि में समूहों के रूप में देखा जाता है.
चित्रा 2 और 96 घंटे के बाद वर्ग स्विच पुनर्संयोजन प्रसार. (क) LPS लिए CFSE कमजोर पड़ने संस्कृति में 96 घंटे के बाद कोशिकाओं को प्रेरित. प्रत्येक स्वतंत्र चोटी एक स्वतंत्र कोशिका विभाजन के लिए इसी CFSE प्रतिदीप्ति में एक कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करता है. (ख) IgG3 अभिव्यक्ति एक IgG3 कोशिका विभाजन के कई दौर के बाद सकारात्मक जनसंख्या के उद्भव दिखा.
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Discussion
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के लिए एक मानक प्राथमिक murine बी कोशिकाओं के वर्ग स्विचन के दौरान सहायता अभिव्यक्ति और समारोह का विश्लेषण परख प्रदान करता है. यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल LPS का उपयोग करता है आईजीएम से IgG3 करने के लिए स्विचन प्रेरित है, हालांकि उत्तेजना मीडिया के लिए संशोधन करने के लिए अन्य isotypes (तालिका 1 8, 9 में संक्षेप) के लिए स्विचन प्रेरित किया जा सकता है है.
हम उल्लेख किया है कि, के रूप में अभी तक अज्ञात कारणों के लिए, भ्रूण बछड़ा सीरम वर्ग इन विट्रो में मनाया स्विचन के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं. यह महत्वपूर्ण है कि एक ही बहुत संख्या सीएसआर के सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा प्रयोगात्मक स्थिरता सुनिश्चित करने. यह भी करने के लिए इन विट्रो स्विचन दरों में इष्टतम पाने भ्रूण बछड़ा सीरम स्रोतों के एक पैनल स्क्रीन फायदेमंद हो सकते हैं. माउस उपभेदों भी कक्षा 10 इन विट्रो में देखा स्विचन की डिग्री को प्रभावित कर सकते हैं . प्रश्न में परख के आधार पर, खराब murine मॉडल SJL माउस, जैसे स्विचन, पर्याप्त C57BL / 6 से प्रशंसनीय स्विचन दरों पाने पृष्ठभूमि backcrossed चाहिए.
चरण मैं लोप हो सकता है अगर एक शुद्ध बी सेल संस्कृति वांछित नहीं है. प्लीहा - संबंधी कोशिकाओं के एक मिश्रण की उत्तेजना अभी भी वर्ग स्विचन प्रेरित होगा, हालांकि यह apoptotic गैर - बी कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में परिणाम कर सकते हैं. इसके अलावा, बाद में प्रवाह cytometric विश्लेषण एक स्थापित बी सेल मार्कर (जैसे B220, CD19) शामिल करना चाहिए. शुद्धि इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता किट StemCell टेक्नोलॉजीज द्वारा आपूर्ति की है (अभिकर्मकों तालिका देखें). वैकल्पिक किट है कि एक नकारात्मक संवर्धन प्रक्रिया का उपयोग भी निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है.
CFSE प्रतिदीप्ति बहुत तीव्र है और इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक उचित मुआवजा नियंत्रण की आवश्यकता कर सकते हैं. इसके अलावा, CFSE धीरे समय के साथ समग्र प्रतिदीप्ति की कमी में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के बाहर रिसाव जाएगा. इन कारणों के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि सभी प्रयोगों एक unstimulated सेल CFSE से सना हुआ आबादी शामिल है. समय की एक छोटी अवधि के दौरान, इन कोशिकाओं संस्कृति में स्थिर बनी रहती है और इस प्रकार CFSE के लिए एक मुआवजा नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और गैर proliferating सेल आबादी की पहचान.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उपयोगी विचार - विमर्श के लिए मार्टिन प्रयोगशाला के लिए आभारी हैं. इस प्रकाशन में कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (एमओपी 89,783) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है. AM कनाडा अनुसंधान चेयर टियर द्वितीय पुरस्कार द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
