Summary
抗原曝露後、活性化B細胞の亜集団は、異なるエフェクター機能を有する抗体のアイソタイプを生成するためにクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているプロセスを経る。このレポートに記載されているプロトコルは、CSRを誘導して分析できる方法について説明します。
Abstract
体液性免疫はB細胞によって維持されると抗体の分泌を介して免疫系の分岐です。 B細胞の活性化により、免疫グロブリンの遺伝子座は、結合能と分泌される抗体のエフェクター機能を変更するために遺伝的改変のシリーズを受ける。このプロセスは、デフォルトのIgM抗体のアイソタイプがIgG抗体は、IgA、またはIgEのいずれかに置換されているクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているゲノムの組換え事象によって強調表示されます。それぞれのアイソタイプは、それによって免疫の維持にCSRが重要な意思異なるエフェクター機能を持っています。
免疫グロブリン遺伝子座の多様化は、酵素活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）によって媒介される。詳細にこのプロセスを説明する回路図ビデオがオンラインで入手可能（http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html）です。 AIDの活動とCSRの経路は、一般的にB細胞の機能とマウスにおける液性免疫の評価で検討されています。このレポートに記載されているプロトコルは、IgG3（他の抗体アイソタイプについては表1を参照）に切り替えるクラスを誘導する細菌のリポ多糖（LPS）をマウス脾臓とその後の刺激からのB細胞の単離の方法を提示。さらに、蛍光細胞染色色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）が刺激された細胞の細胞分裂、スイッチング1、2をアイソタイプに重要なプロセスを監視するために使用されます。
AIDとCSRが発生するメカニズムの規制はまだ明らかではないため、in vitroでのクラススイッチのアッセイで 、様々なマウスモデルでこれらのプロセスをテストするための信頼性の高い方法を提供する。これらのアッセイは、以前は次のノックアウトマウス3を用いて遺伝子の欠損のコンテキストで使用されている。さらに、B細胞のスイッチングのin vitroでのRNAノックダウンまたは導入遺伝子の発現4-6に遺伝子発現を調節するためにウイルスの伝達を付けることができます。実験のこれらのタイプからのデータは、AIDの活動、CSRの反応の解像度、およびマウスにおける抗体媒介性免疫の理解に影響を及ぼしている。
Protocol
ステップI：磁気濃縮を経由して脾臓B細胞の分離を
- 実験用マウスは、免疫システムの完全な成熟を確保するために8〜12週間熟成されるべきである。
- 頚椎脱臼によりマウスを安楽死させると70％エタノールに浸漬。外科的腹部の左季肋部の皮膚と筋肉を通して切開を行うことによって脾臓を除去し、リン酸塩の3大部分にカット（PBS）緩衝生理食塩水。すべてのツールおよび試薬は無菌であることを確認してください。
- 1 mLのシリンジプランジャ、軽くマッシュPBSに70μmのセルストレーナーを介して脾臓のゴムの端を使用する。研削が大きい（増殖すなわち）細胞の破裂につながる可能性があるので押す動きではなく、研削モーションを使用してください。
- 5分間のこれ以上の350よりもgで細胞をスピンダウンし、PBSでペレットを再懸濁します。血球計数器を用いて再懸濁した細胞を数えます。
- キャップ付き滅菌5mLのポリスチレンチューブ（チューブあたり2 mLの最大音量）の5％正常ラット血清を含むPBSで1 × 10 8細胞/ mlの懸濁液を準備する。
- 細胞のあらゆるmLのためのEasySep負の選択マウスのB細胞の濃縮カクテルの50μLを追加。混合物をピペット、チューブにキャップをし、15分間冷蔵庫に入れてください。
- 細胞のあらゆる液を100μLEasySepビオチン選択カクテルを追加。混合物をピペット、チューブにキャップをし、15分間冷蔵庫に入れてください。
- 細胞のあらゆるmLのEasySep磁性ナノ粒子を100μLを（ナノ粒子がよく混合され、溶液が均質であることを確認）を追加します。混合物をピペット、チューブにキャップをし、5分間冷蔵庫に入れてください。
- PBSで5分間EasySep磁石の位置と2.5mLのトップへソリューションを提供します。磁石とチューブを逆さにして新しいポリスチレンチューブに迅速に注ぐ。否定的に選択したセルが磁気チューブの壁にバインドされるようにチューブを振らないでください。
- さらに細胞懸濁液の純度を高めるために、管をさらに5分間磁石に再挿入し、新しいチューブに注いだことがあります。これは、全体の細胞の回復を減らすことができます。
- B細胞の純度は、B細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析によって評価することができる。濃縮に続いて、我々は一貫して> 95％B220陽性細胞の純度を参照してください。
CFSE細胞の染色ステップII：
- mL当たり1 × 10 6細胞の最終濃度でアルブミン0.1％ウシ血清を添加した温かいPBSで分離した細胞を再懸濁します。
- CFSE（無菌ジメチルスルホキシドで希釈）の5mMのストック溶液を調製し、チューブ内の細胞のあらゆるmLの場合、2μlのを追加します。 10μMの最終濃度は、主要なB細胞の染色に最適です。
- 37℃暗所で10分間（注：CFSEは光に敏感であり、可能な場合は暗所に保管してください）。
- あなたの細胞に仔ウシの血清の等量を追加し、5分間氷上でインキュベートすることにより、汚れを癒やす。
- gを（レシピのステップIIIを参照）培養液のチューブを補充し、350で遠心分離で細胞を洗浄メディアの少なくとも5倍のボリュームに相当するが、仔ウシの血清の粘度を打ち消すようにし、細胞ペレットを生成するために追加しなければならないことに注意してください。
- 培地で2回細胞を洗浄。セルは刺激のための準備が整いました。
ステップIII：LPSによる細胞の刺激を
- 10％ウシ胎児血清および50μMβ-メルカプトエタノール/を含むRPMI 1640を補完することによりin vitroで B細胞の培養液中で自分を準備します。
- 50μg/mLの最終濃度でLPSを追加して、刺激のメディアを準備します。フラットボトムの各ウェルを96ウェル組織培養プレートに刺激の培地のアリコートを125μL。
- 3.2 × 10 6細胞/ mlの最終濃度でLPSを含まない培地でCFSE染色B細胞を準備します。穏やかにピペッティングすることにより、刺激媒体とミックスを含むウェルに細胞懸濁液125μLを加える。
- 各ウェルは、25μg/ mLの最終的なLPSの濃度で4 × 10 5個の細胞が含まれています。これらの値に変化が必要に応じて行うことができるが、これは、細胞増殖とクラスのスイッチングの最適なレベルを提供します。
- 37℃、72〜96時間、5％CO 2の細胞をインキュベート。 48時間後、大規模な増殖B細胞のクラスターは、顕微鏡下ではっきりと見えるようになります。
ステップIV：クラススイッチングのフローサイトメトリー分析
- あなたがクラススイッチを見て準備ができたら、彼らの文化の条件からあなたの細胞を除去し、染色バッファー（2％仔ウシ血清を含むPBS）1mLに二度、それらを洗ってください。
- 350グラムとインキュベーションでそれらをスピンダウンして、細胞、細胞をペレット化の非特異的な抗体染色を防ぐために5％正常マウス血清と氷上で15分間FcBlock per106細胞の1μgのでバッファを染色の100μLのTEそれら。細胞のブロッキングは氷上で行ってください。
- あなたの細胞を洗浄せずに、蛍光標識抗マウスIgG3抗体の10 6個の細胞あたり1μgのを追加し、細胞は氷上で30分間染色することができます。
- 染色バッファーの200から300μLで遠心分離と再懸で細胞を2回洗浄する。セルはフローサイトメトリーによる評価のための準備が整いました。
- CFSEは最適波長492 nmで励起（アルゴンイオンレーザーによる）、517 nmで放出される。 IgG3抗体の励起および発光スペクトルは、その共役蛍光色素に依存しています。
代表的な結果
磁気濃縮の後、細胞懸濁液は区別がつかない小さな円形の細胞（図1A）の均質な集団のようになります。刺激の48〜72時間後、拡大増殖細胞の分離されたクラスターは、（図1B）はっきりと見えるようになります。彼らはアポトーシスを起こすように、非増殖細胞の大部分は小さな粒度の細かい表示されます。
細胞のほとんどが7を死ぬことを開始する前に、CSRは、通常は刺激後72および96時間の間に最高レベルで検出することができます。この段階で、細胞は後に娘細胞の集団で現れる切り替え細胞と細胞分裂の数を受けているはずです。 CFSEで希釈し、LPS刺激の96時間後のIgG3の表面発現の代表的なフローサイトメトリープロットを図2に見ることができます。
表1。カクテルを切り替えアイソタイプ。注：覚せい濃度値は、推奨事項のみです。滴定が必要になる場合があります。
| 希望のアイソタイプ | 刺激のカクテル |
| IgG1and IgE値 | LPS（25μg/mL）およびIL - 4（10 ng / mL）を |
| IgG1and IgE値 | 抗CD40（10μg/mL）およびIL - 4（10 ng / mL）を |
| 的なIgG2a | LPS（25μg/mL）およびIFN -γ（10 ng / mL）を |
| IgG2b及びIgG3に | LPS（25μg/mL） |
| IgAの | LPS（25μg/mL）、TGF -β（2 ng / ml）およびIL - 5（1.5 ng / mL）を |
図1。単離及び脾臓B細胞のLPS刺激。 （）磁気LPSの刺激の前に脾臓B細胞を濃縮。 （B）48時間LPSの25μg/ mLので刺激した後。増殖する細胞は、ブラストおよびアポトーシス細胞のバックグラウンドでのクラスターとして見られている。
図2。96時間後の増殖とクラススイッチ組み換え。 （A）LPSのためのCFSEの希釈は、文化の中で96時間後に細胞を刺激した。それぞれ独立したピークは、独立した細胞分裂に対応するCFSEの蛍光の希釈を表しています。 （B）細胞分裂のいくつかのラウンドに続くIgG3に肯定的な人口の出現を示すIgG3に表現。
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Discussion
上記で概説プロトコルは、プライマリマウスB細胞のクラススイッチの間にAIDの発現と機能を解析する標準的なアッセイを提供する。刺激のメディアへの変更は、他のアイソタイプ（表1 8、9に示す）に切り替える誘導できるものはありますが、このプロトコルでは、IgMからIgG3にするためにスイッチング誘導する細菌のLPSを使用しています。
我々がいることを指摘している、まだのような未知の理由のために、ウシ胎児血清はin vitroで観察されたスイッチングクラスのレベルに影響を与える可能性があります。それは、同一のロット番号は、実験的な一貫性を確保するために、すべてのCSRの実験に使用することが重要です。それはまた 、in vitroのスイッチング速度に最適な達成するためにウシ胎児血清ソースのパネルをスクリーニングするために有益であるかもしれません。マウス系統はまた 、in vitro 10 で見られるクラスの切り替えの度に影響を与える可能性があります。悪いようなSJLマウスのようなマウスモデルを、スイッチング、質問にアッセイに応じて、かなりのスイッチング速度を達成するために十分にC57BL / 6背景に戻し交配にする必要があります。
純粋なB細胞の培養が望まれていない場合、私は省略することができるステップ。それはアポトーシス非B細胞の大きな集団につながるかもしれないが脾細胞の混合物の刺激は、まだ、クラススイッチを誘導する。さらに、その後のフローサイトメトリー分析は、確立されたB細胞のマーカー（例：B220、CD19）を含める必要があります。このプロトコルで使用されている精製キットは、StemCell Technologies社（試薬の表を参照）によって提供されます。負の濃縮プロセスを使用する代替のキットはまた、製造業者の指示に従って使用することができます。
CFSEの蛍光は非常に激しいことができますので、それぞれの実験では、フローサイトメトリー分析のための適切な補償制御が必要です。さらに、CFSEはゆっくり時間をかけて全体の蛍光の減少、その結果細胞外にリークします。これらの理由から、それはすべての実験は、刺激CFSE染色の細胞集団を含めることをお勧めします。短期間で、これらの細胞は、培養中の静的のままになり、したがってCFSEの補償制御として使用することができますし、非増殖細胞集団を同定する。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は有用な議論のためのマーティンの研究室に感謝しています。この出版物は、保健研究のカナダ研究所（MOP - 89783）からの助成金によってサポートされています。 AMは、カナダのリサーチチェアティアII賞でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
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