Summary
После антигеном экспозицию, субпопуляции активированных В-клеток проходят процесс, известный как класс рекомбинации переключатель (КСО), чтобы произвести антитела изотипов с различными эффекторные функции. Протокол изложенные в настоящем докладе объясняет, как КСО может быть вызвана и проанализирована
Abstract
Гуморальный иммунитет ветви иммунной системы ведет В-клетки и опосредуется через секрецию антител. После активации В-клеток, иммуноглобулинов локус претерпевает ряд генетических модификаций изменить связывающей способности и эффекторные функции выделяются антитела. Этот процесс будет выделено по геномной событие рекомбинации известный как класс рекомбинации переключатель (КСО), в которых антитела IgM изотипа умолчанию заменяется одним из IgG, IgA или IgE. Каждый изотип обладает различными эффекторных функций в результате чего КСО решающее значение для поддержания иммунитета.
Диверсификация иммуноглобулина локус опосредовано активации ферментов вызванных цитидиндезаминазы (AID). Схема видео, описывающие этот процесс подробно можно ознакомиться в Интернете (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Деятельности AID и пути КСО, как правило, учились в оценке B функции клеточного и гуморального иммунитета у мышей. Протокол, изложенных в настоящем докладе представлены метод В-клеток изоляции от мышиной селезенки и последующего стимулирования с бактериальными липополисахарида (ЛПС), чтобы вызвать класс переход на IgG3 (для других изотипов антител см. Таблицу 1). Кроме того, люминесцентные ячейки окрашивания красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) используется для контроля клеточного деления стимулированных клеток, процесс решающее значение для переключения изотипа 1, 2.
Регулирование AID и механизм, посредством которого происходит КСО, все еще неясны и, следовательно, в анализах пробирке класса переключатель обеспечивает надежный метод для проверки этих процессов в различных моделях мыши. Эти анализы были ранее использованы в контексте гена дефицита использованием нокаутом мышей 3. Кроме того, в пробирке переключение В-клеток может предшествовать вирусная трансдукция модулировать экспрессию генов РНК нокдаун или экспрессии трансгена 4-6. Данные из этих типов экспериментов повлияли наше понимание ПОМОЩИ деятельности, разрешение реакции КСО, и антитела, иммунитет у мышей.
Protocol
Шаг I: Выделение клеток селезенки через магнитное обогащение
- Экспериментальные мыши должны быть в возрасте 8-12 недель для обеспечения полного созревания иммунной системы.
- Эвтаназии мыши цервикальным сдвигом и замочить в 70% этанола. Хирургическим путем удалить селезенку, сделав разрез через кожу и мышцы левого подреберья брюшной полости и разрезать его на три большие части в фосфатным буферным раствором (PBS). Убедитесь, что все инструменты и реактивы стерильными.
- Использование резиновых конце 1 мл шприца, аккуратно пюре селезенки через 70 мкм ячейка ситечко в PBS. Обязательно используйте нажатием движения, а не шлифовального движения, как измельчение может привести к разрыву больше (т.е. пролиферирующих) клетках.
- Спином вниз клетки на уровне не более 350 г в течение 5 минут и ресуспендируют осадок в PBS. Граф ресуспендировали клеток с использованием гемоцитометра.
- Подготовка приостановлении 1х10 8 клеток / мл в PBS с 5% нормальной сыворотки крыс в стерильные 5 мл трубки полистирола с крышкой (максимальный объем 2 мл на трубку).
- Добавить 50 мкл EasySep негативный отбор мышь B сотовых Обогащение коктейль для каждого мл клеток. Внесите смеси, крышка трубы, и поставить в холодильник на 15 минут.
- Добавить 100 мкл EasySep Биотин выбору коктейль для каждого мл клеток. Внесите смеси, крышка трубы, и поставить в холодильник на 15 минут.
- Добавить 100 мкл EasySep магнитных наночастиц (обеспечение наночастицы хорошо перемешивают и решение однородных) для каждого мл клеток. Внесите смеси, крышка трубы, и поставить в холодильник на 5 минут.
- Топ решение с 2,5 мл PBS и место в EasySep магнитом в течение 5 минут. Обратить магнит и трубу и залить быстро в новые трубки полистирола. Не трясите трубку, как негативно выбранных ячеек будет связана с магнитной стенки трубы.
- Для дальнейшего повышения чистоты клеточной суспензии, труба может быть вставлен в магнит для дополнительных 5 минут и выливают в новую трубу. Это может уменьшить общее восстановление клеток.
- В-клеток чистоты можно оценить с помощью проточной цитометрии маркеров В-клеток поверхности. После обогащения, мы постоянно видим чистоты> 95% B220-положительных клеток.
Шаг II: окрашивание CFSE ячейки
- Ресуспендируют изолированных клеток в теплую PBS дополнена 0,1% бычьего сывороточного альбумина в конечной концентрации 1 х 10 6 клеток на мл.
- Подготовка 5 мМ раствор запас CFSE (разводят в стерильной диметилсульфоксид) и добавить 2μL для каждого мл клеток в пробирке. Конечной концентрации 10 мкм является оптимальным для окрашивания первичных клеток.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 10 минут в темноте (примечание: CFSE является светочувствительным и должен храниться в темноте, когда это возможно).
- Quench пятно, добавляя равный объем телячьей сыворотки теленка со своими клетками и инкубации на льду в течение 5 минут.
- Вымойте клеток пополнения трубки с питательной среде (см. шаг III для рецепта) и центрифугирования при 350 g. Обратите внимание, что по крайней мере в 5 раз объем эквивалент средства массовой информации должны быть добавлены к противодействию вязкость бычьей сыворотки теленка и клетки для производства гранул.
- Вымойте клетки в два раза больше в культуральной среде. Клетки готов к стимуляции.
Шаг III: Сотовый стимуляции LPS
- Подготовка в пробирке В среду клеточной культуры, дополняя RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 50 мкМ β-меркаптоэтанол /.
- Подготовьте свой стимуляции среду, добавив ЛПС в конечной концентрации 50μg/mL. Алиготе 125 мкл стимуляции среды в каждую лунку плоским дном 96-луночный планшет тканевой культуры.
- Подготовьте свой CFSE окрашенных клеток в культуральной среде без LPS в конечной концентрации 3,2 х 10 6 клеток / мл. Добавить 125 мкл суспензии клеток в лунки содержащий среду стимуляции и перемешать с помощью пипетки осторожно.
- Каждая скважина в настоящее время содержит 4 х 10 5 клеток в конечной концентрации ЛПС от 25 мкг / мл. Это обеспечивает оптимальные уровни клеточной пролиферации и класс переключения, хотя изменения в эти значения могут быть сделаны как хотелось бы.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 72 до 96 часов. Через 48 часов, скопления большого пролиферирующих клеток будут хорошо видны под микроскопом.
Шаг IV: проточной цитометрии класса переключения
- Когда вы будете готовы взглянуть на класс переключение, снимите ваши клетки от условий культуры и мыть их дважды в 1 мл окрашивания буфера (PBS с 2% бычьей сыворотки теленка).
- Для предотвращения неспецифических антител окрашивания ваши клетки, пеллет клетки, крутя их вниз на 350 г и инкубацииТе их в 100 мкл буфера окрашивания с 5% нормальной сывороткой мыши и 1 мкг из FcBlock per106 клетки в течение 15 минут на льду. Сотовые блокировка должна быть выполнена на льду.
- Без мытья клеток, добавить 1 мкг на 10 6 клетки флуоресцентной меткой анти мыши IgG3 антител и позволяют клеткам пятно в течение 30 минут на льду.
- Вымойте клетки в два раза путем центрифугирования и ресуспендируют в 200-300 мкл окрашивания буфера. Клетки готов к оценке методом проточной цитометрии.
- CFSE оптимально возбуждается на 492 нм (по аргон-ионный лазер) и излучает при 517 нм. Возбуждения и спектр излучения антител IgG3 зависит от его сопряженное флуоресцентным красителем.
Представитель Результаты
После магнитного обогащения, клеточной суспензии должен выглядеть однородным населением неотличимы маленькие круглые клетки (рис. 1А). После 48-72 часов стимуляции, изолированных кластеров увеличенной пролиферирующие клетки будут хорошо видны (рис. 1В). Большая часть не-пролиферирующие клетки появится небольшая и гранулированный, поскольку они подвергаются апоптозу.
КСО как правило, могут быть обнаружены на самом высоком уровне между 72 и 96 часов после стимуляции, прежде чем большинство из клетки начинают умирать 7. На данном этапе клетки должны претерпели число клеточных делений с включенным клетки появляются в более поздние популяции клеток дочь. Представитель проточной цитометрии участок разведения CFSE и поверхностных выражение IgG3 после 96 часов стимуляции LPS можно увидеть на рисунке 2.
Таблица 1. Изотип переключения коктейлей. Примечание: значения концентрации стимуляторов носят рекомендательный характер. Титрование может быть необходимым.
| Желаемый Изотип | Стимуляция коктейль |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) и IL-4 (10 нг / мл) |
| IgG1and IgE | Анти-CD40 (10μg/mL) и IL-4 (10 нг / мл) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) и IFN-γ (10 нг / мл) |
| IgG2b и IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 нг / мл) и IL-5 (1,5 нг / мл) |
Рисунок 1. Выделение и ЛПС стимуляции клеток селезенки. (А) Магнитное обогащенного селезенки клеток до стимуляции ЛПС. (Б) 48 часов после стимуляции 25 мкг / мл LPS. Пролиферирующие клетки считаются кластеры в фоне взрывных работ и апоптоза клеток.
Рисунок 2. Оружия и рекомбинации класса переключателя после 96 часов. () CFSE разбавления для LPS стимулировать клеток после 96 часов в культуре. Каждый независимый пик представляет растворение в CFSE флуоресценции соответствующие независимые деления клеток. (Б) IgG3 выражение показывает появление IgG3 положительные населения после нескольких раундов деления клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол описанных выше предоставляет стандартный анализ для анализа выражения AID и функции во время класса переключение первичных мышиных клеток. Этот протокол использует бактериальных ЛПС, чтобы вызвать переход от IgM к IgG3, хотя изменения в стимуляции массовой информации могут быть сделаны, чтобы вызвать переход на другие изотипов (приведены в таблице 1 8, 9).
Мы отметили, что, по неизвестной пока причине фетальной телячьей сыворотки могут повлиять на уровень класса переключение наблюдаются в лабораторных условиях. Очень важно, чтобы столько же много быть использован для всех экспериментов КСО для обеспечения экспериментальных консистенции. Он также может быть полезным для экрана панели эмбриональной телячьей сыворотки источников для достижения оптимальных ставок пробирке переключения. Мышь штаммы также могут влиять на степень класса переключения видели в пробирке 10. В зависимости от анализа идет речь, плохо переключения мышиной модели, такие как SJL мыши, должно быть достаточно, чтобы backcrossed C57BL / 6 фоном для достижения заметного переключение ставок.
Шаг I может быть опущена, если чистая клетка B культуры нежелательно. Стимуляции смесь селезенки клетках будут по-прежнему вызывают класса переключения, хотя это может привести к большим населением апоптотических не-В-клеток. Кроме того, последующие проточной цитометрии анализа должны включать установленные маркером В-клеток (например, B220, CD19). Комплект очистки, используемые в настоящем протоколе поставляется StemCell технологий (см. таблицу реагентов). Альтернативные комплекты, которые используют негативный процесс обогащения также могут быть использованы в соответствии с инструкциями производителя.
CFSE флуоресценции может быть очень интенсивным и, таким образом каждый эксперимент требует надлежащего контроля компенсации за проточной цитометрии. Кроме того, CFSE будет медленно просачиваться клеток, в результате чего снижение общих флуоресценции с течением времени. По этим причинам, рекомендуется, что все эксперименты включают нестимулированных CFSE окрашенных клеточной популяции. За короткий период времени, эти клетки будут оставаться неизменными в культуре и тем самым могут быть использованы в качестве компенсации управления CFSE и определить, не пролиферирующих клеток населения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарны лаборатории Мартина за полезные обсуждения. Эта публикация опирается на грант Канадского института исследований в области здравоохранения (СС-89783). AM поддерживается Председатель Канаде исследований премии Tier II.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
