Summary
Después de la exposición al antígeno, las subpoblaciones de linfocitos B activados sufren un proceso conocido como recombinación de cambio de clase (CSR) para producir isotipos de anticuerpos con diferentes funciones efectoras. El protocolo se describe en este informe se explica cómo la RSE puede ser inducida y analizados
Abstract
La inmunidad humoral es la rama del sistema inmune que mantiene las células B y mediado a través de la secreción de anticuerpos. Tras la activación de células B, el locus de la inmunoglobulina se somete a una serie de modificaciones genéticas para alterar la capacidad de unión y función efectora de los anticuerpos secretados. Este proceso se destaca por un evento de recombinación genómica conocida como recombinación de cambio de clase (CSR) en el que se sustituye el isotipo IgM por defecto para un anticuerpo de IgG, IgA o IgE. Cada isotipo posee distintas funciones efectoras con lo que la RSC crucial para el mantenimiento de la inmunidad.
Diversificación de la locus de la inmunoglobulina es mediada por la enzima citidina deaminasa inducida por activación (AID). Un vídeo esquema que describe este proceso en detalle está disponible en línea (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). La actividad de la AID y la vía de RSC son comúnmente estudiados en la evaluación de la función de las células B y la inmunidad humoral en ratones. El protocolo se describe en este informe se presenta un método de aislamiento de células B del bazo murino y posterior estimulación con lipopolisacárido bacteriano (LPS) para inducir el cambio a la clase IgG3 (para otros isotipos de anticuerpos ver Tabla 1). Además, la tinción de células fluorescentes de tinte carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) se utiliza para controlar la división celular de las células estimuladas, un proceso crucial para el cambio de isotipo 1, 2.
La regulación de la AID y el mecanismo por el que la RSE se produce aún no están claros y por lo tanto en ensayos in vitro de cambio de clase proporcionan un método confiable para las pruebas de estos procesos en modelos de ratones diferentes. Estos ensayos se han utilizado anteriormente en el contexto de la deficiencia de genes utilizando ratones knockout 3. Además, in vitro el cambio de las células B puede estar precedido por la transducción viral para modular la expresión génica mediante ARN derribo o la expresión del transgén 4-6. Los datos de este tipo de experimentos han impactado a nuestra comprensión de la actividad de AID, la resolución de la reacción de la RSE, y la inmunidad mediada por anticuerpos en los ratones.
Protocol
Paso I: Aislamiento de las células B del bazo a través de enriquecimiento magnética
- Ratones experimentales deben ser mayores de 8-12 semanas para asegurar plena maduración del sistema inmunológico.
- Sacrificar al ratón por dislocación cervical y de inmersión en etanol al 70%. Extraer quirúrgicamente el bazo al realizar una incisión a través de la piel y el músculo del hipocondrio izquierdo del abdomen y lo cortó en tres trozos grandes en tampón fosfato salino (PBS). Asegúrese de que todas las herramientas y los reactivos son estériles.
- Con el extremo de caucho de un émbolo de una jeringa ml, suavemente mezcla del bazo a través de un filtro de 70 micras de células en PBS. Asegúrese de utilizar un movimiento de empujar en lugar de un movimiento de trituración de molienda puede conducir a la ruptura de los más grandes (es decir, la proliferación) las células.
- Centrifugar las células a no más de 350 g por 5 minutos y resuspender el precipitado en PBS. Contar las células se resuspendieron utilizando un hemocitómetro.
- Preparar una suspensión de 1x10 8 células / ml en PBS con suero de rata 5% de lo normal en un tubo de poliestireno estériles de 5 ml con tapa (volumen máximo de 2 ml por tubo).
- Añadir 50 l de EasySep ratón negativo selección de cócteles enriquecimiento de las células B por cada ml de células. Pipeta de la mezcla, la tapa de los tubos, y colocar en la nevera durante 15 minutos.
- Añadir 100 ml EasySep Cocktail Selección biotina por cada ml de células. Pipeta de la mezcla, la tapa de los tubos, y colocar en la nevera durante 15 minutos.
- Añadir 100 ml de EasySep nanopartículas magnéticas (garantizar las nanopartículas se mezclan bien y la solución es homogénea) por cada ml de células. Pipeta de la mezcla, la tapa de los tubos, y colocar en la nevera durante 5 minutos.
- Parte superior de la solución a 2,5 ml con PBS y colocar en un imán EasySep durante 5 minutos. Invertir el imán y el tubo y se vierte rápidamente en un tubo de poliestireno de nuevo. No agite el tubo de las células negativamente seleccionados serán magnético unido a las paredes del tubo.
- Para aumentar aún más la pureza de la suspensión celular, el tubo puede ser reinsertado en el polo de atracción para otros 5 minutos y se vierte en un tubo nuevo. Esto puede reducir la recuperación general de la célula.
- La pureza de las células B puede ser evaluada por citometría de flujo de los marcadores de superficie de la célula B. Después del enriquecimiento, que constantemente ve una pureza de> 95% de células positivas B220.
Paso II: tinción de células CFSE
- Resuspender las células aisladas en caliente PBS suplementado con 0,1% de albúmina sérica bovina a una concentración final de 1 x 10 6 células por ml.
- Preparar una solución de 5 mm de CFSE (diluido en dimetilsulfóxido estéril) y añadir 2μL por cada ml de células en el tubo. La concentración final de 10μM es óptimo para la tinción de las células B primario.
- Se incuba a 37 ° C durante 10 minutos en la oscuridad (nota: la CFSE es sensible a la luz y se debe mantener en la oscuridad cuando es posible).
- Apagar la mancha mediante la adición de un volumen igual de suero de ternera bovina a las células e incubar en hielo durante 5 minutos.
- Lavar las células por añadir los tubos con medio de cultivo (véase el paso III de la receta) y centrifugado a 350 g. Tenga en cuenta que por lo menos 5 veces el equivalente del volumen de los medios de comunicación hay que añadir para contrarrestar la viscosidad del suero de ternera de vacuno y de las células para producir una pastilla.
- Lavar las células dos veces más en medio de cultivo. Las células están listas para la estimulación.
Paso III: la estimulación de células con LPS
- Prepare su medio de cultivo in vitro de células B, completándolo RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% y M 50 / β-mercaptoetanol.
- Preparar el medio de la estimulación mediante la adición de LPS a una concentración final de 50μg/mL. Alícuota de 125 l del medio de la estimulación en cada pocillo de una placa de fondo plano de cultivo de tejidos de 96 pocillos.
- Prepare su manchadas CFSE células B en el medio de cultivo sin LPS a una concentración final de 3,2 x 10 6 células / ml. Añadir 125 l de la suspensión celular a los pozos que contienen el medio de la estimulación y mezclar con la pipeta suavemente.
- Cada bien ahora consta de 4 x 10 5 células en una concentración final de 25 LPS mg / ml. Esto proporciona un nivel óptimo de la proliferación celular y cambio de clase, a pesar de las alteraciones de estos valores se puede hacer a su gusto.
- Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 72 a 96 horas. Después de 48 horas, los grupos de grandes células B proliferan será claramente visible bajo el microscopio.
Paso IV: Análisis de citometría de flujo de cambio de clase
- Cuando esté listo para ver el cambio de clase, eliminar las células de las condiciones de su cultura y lavar dos veces en 1 ml de buffer de tinción (PBS con 2% de suero bovino de ternera).
- Para evitar tinción no específica de anticuerpos de las células, que sedimenten las células al girar hacia abajo a 350 g y incubaciónte en 100μL de buffer de tinción con suero de ratón normal y 5% de 1 g de FcBlock per106 las células durante 15 minutos en hielo. El bloqueo de celulares se debe realizar en el hielo.
- Sin lavarse las células, añadir 1 g por cada 10 6 células de un ratón anti marcado con fluorescencia de anticuerpos IgG3 y permitir que las células se mancha durante 30 minutos en hielo.
- Lavar las células dos veces por centrifugación y se resuspenden en 200 a 300 l de buffer de tinción. Las células están listas para la evaluación por citometría de flujo.
- CFSE es óptima emocionado a 492 nm (por un láser de argón-ion) y emite a 517 nm. El espectro de excitación y emisión de los anticuerpos IgG3 depende de su tinte fluorescente conjugada.
Resultados representante
Después del enriquecimiento magnética, la suspensión celular debe verse como una población homogénea de células indistinguibles pequeña circular (fig. 1A). Después de 48-72 horas de estimulación, grupos aislados de agrandamiento de la proliferación de células será claramente visible (fig. 1B). Una gran proporción de las células no proliferantes aparecerán pequeñas y granulares, ya que la apoptosis.
RSE puede ser detectada normalmente al más alto nivel entre 72 y 96 horas después de la estimulación antes de que la mayoría de las células comienzan a morir 7. En esta etapa, las células que han sufrido una serie de divisiones celulares con células cambió aparecen en la población de células hijas más tarde. Un diagrama de flujo de citometría de representante de la dilución CFSE y la expresión superficial de IgG3 después de 96 horas de estimulación con LPS se puede ver en la Figura 2.
Tabla 1. Isotipo cócteles. Nota: Los valores de concentración de estimulantes son sólo recomendaciones. Titulaciones que sean necesarias.
| Isotipo deseado | Estimulación Cocktail |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) e IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) e IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) e IFN-γ (10 ng / mL) |
| IgG2b e IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) e IL-5 (1,5 ng / mL) |
Figura 1. Aislamiento y estimulación con LPS de células B del bazo. (A) magnéticamente enriquecido células del bazo B antes de la estimulación con LPS. (B) 48 horas después de la estimulación con 25 mg / ml de LPS. Proliferación de las células se ven como las agrupaciones en un fondo de células apoptóticas y voladuras.
Figura 2. Proliferación y la recombinación de cambio de clase después de 96 horas. (A) la dilución CFSE para LPS estimula las células después de 96 horas en la cultura. Cada pico independiente representa una dilución de la fluorescencia CFSE que corresponde a una división de las células independientes. (B) la expresión IgG3 que muestra el surgimiento de una población IgG3 positivo después de varias rondas de división celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo descrito anteriormente proporciona un estándar de ensayo para analizar la expresión de la AID y la función durante el cambio de clase de primaria de las células B murinas. Este protocolo utiliza bacteriana LPS para inducir el cambio de IgM a IgG3, a pesar de las modificaciones a los medios de estimulación se puede hacer para inducir el cambio a otros isotipos (que se resumen en la Tabla 1 8, 9).
Hemos tomado nota de que, por razones aún desconocidas, suero bovino fetal pueden afectar el nivel de la clase de cambio observado in vitro. Es fundamental que el mismo número de lote se utilizará para todos los experimentos de RSC para asegurar la consistencia experimental. También puede ser beneficioso a la pantalla de un panel de suero de ternera fetal fuentes para alcanzar óptimos en las tasas de cambio vitro. Cepas de ratón también puede afectar el grado de cambio de clase visto in vitro 10. Dependiendo del ensayo en cuestión, mal cambiar los modelos murinos, como el ratón SJL, debe ser lo suficientemente backcrossed a los C57BL / 6 de fondo para lograr apreciables tasas de cambio.
Paso que puede omitirse si un cultivo puro de células B no es deseable. La estimulación de una mezcla de células del bazo todavía inducir el cambio de clase, a pesar de que puede dar lugar a una mayor población de la apoptosis de células B no. Además, el análisis de citometría de flujo posterior debe incluir un marcador de células B establecida (por ejemplo, B220, CD19). El kit de purificación utilizados en este protocolo es suministrada por StemCell Technologies (ver tabla reactivos). Kits alternativa que utilizar un proceso de enriquecimiento negativo también puede ser utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
CFSE fluorescencia pueden ser muy intensos y por lo tanto cada experimento requiere de un control de compensación adecuados para el análisis de citometría de flujo. Además, la CFSE poco a poco se saldrá de las células resulta en una reducción de la fluorescencia en general a través del tiempo. Por estas razones, se recomienda que todos los experimentos son una estimulada CFSE manchadas de la población de células. Durante un período corto de tiempo, estas células se mantendrán estables en la cultura y por lo tanto puede ser utilizado como un control de compensación de CFSE y para identificar la población de células no proliferantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estamos agradecidos con el laboratorio de Martin útil para los debates. Esta publicación está apoyada por una subvención del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (MOP-89783). AM es apoyado por una investigación de Canadá Premio Cátedra de Nivel II.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
