Summary
Nach Antigen Exposition unterziehen Subpopulationen von aktivierten B-Zellen ein Verfahren, wie class switch Rekombination (CSR) bekannt, dass Antikörper-Isotypen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen zu produzieren. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen erklärt, wie CSR induziert und analysiert werden können
Abstract
Humorale Immunität ist der Zweig des Immunsystems durch B-Zellen gehalten und vermittelt durch die Sekretion von Antikörpern. Bei B-Zell-Aktivierung, erfährt der Immunglobulin-Locus eine Reihe von genetischen Veränderungen, die Bindekapazität und Effektor-Funktion der sekretierten Antikörper verändern. Dieser Prozess wird durch eine genomische Rekombination Veranstaltung als Klasse-Schalter Rekombination (CSR), in denen die Standard-IgM-Antikörper-Isotyp für einen IgG, IgA, IgE oder substituierten bekannt ist hervorgehoben. Jeder Isotyp besitzt verschiedene Effektor-Funktionen wodurch CSR entscheidend für die Aufrechterhaltung der Immunität.
Die Diversifizierung der Immunglobulin-Locus wird durch das Enzym activation-induced Cytidindeaminase (AID) vermittelt. Eine schematische Video beschreibt diesen Prozess im Detail ist online verfügbar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID-Aktivität und der CSR-Weg werden häufig bei der Beurteilung der B-Zell-Funktion und humoralen Immunität in Mäusen untersucht. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen präsentiert eine Methode der B-Zell-Isolierung von murinen Milz und nachfolgende Stimulation mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) zu induzieren Klasse Umstellung auf IgG3 (für andere Antikörper-Isotypen siehe Tabelle 1). Darüber hinaus ist das fluoreszierende Zellfärbung Farbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) verwendet werden, um die Zellteilung der stimulierten Zellen, ein Prozess von entscheidender Bedeutung für Schalt-1, 2 Isotyp zu überwachen.
Die Regulierung der AID und der Mechanismus, durch den CSR auftritt, sind noch unklar und somit in vitro-Klasse-Schalter Assays bieten eine zuverlässige Methode zur Prüfung dieser Prozesse in verschiedenen Mausmodellen. Diese Assays wurden bereits im Zusammenhang mit der Gen-Mangel mit Knockout-Mäusen 3 verwendet. Darüber hinaus können in vitro Schalten von B-Zellen durch virale Transduktion vorangestellt werden, um die Genexpression durch RNA-Zuschlag oder Transgenexpression 4-6. Die Daten aus dieser Art von Experimenten haben unser Verständnis der AID-Aktivität, die Auflösung der CSR-Reaktion und Antikörper-vermittelte Immunität in der Maus beeinflusst.
Protocol
Schritt I: Isolierung von Milz B-Zellen über magnetische Anreicherung
- Experimentelle Mäuse sollten im Alter von 8-12 Wochen in voller Reifung des Immunsystems zu gewährleisten.
- Euthanize der Maus durch Genickbruch und genießen in 70% Ethanol. Chirurgisch entfernen Sie die Milz durch einen Einschnitt durch die Haut und Muskulatur der linken Hypochondrium des Bauches und schneiden Sie es in drei großen Stücken in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Sicherstellen, dass alle Werkzeuge und Reagenzien sind steril.
- Mit dem Gummi Ende einer 1 ml Spritze Kolben, der Milz sanft Maische durch ein 70 um Zellsieb in PBS. Achten Sie darauf, eine schiebende Bewegung statt einer Schleifmaschine Bewegung als Schleifen zum Bruch von größeren (dh proliferierende) Zellen führen kann.
- Spin down die Zellen bei nicht mehr als 350 g für 5 Minuten und das Pellet in PBS. Zählen Sie die resuspendierten Zellen mit einer Zählkammer.
- Eine Suspension von 1x10 8 Zellen / ml in PBS mit 5% normalem Rattenserum in einer sterilen 5 ml Polystyrol Röhrchen mit einer Kappe (maximales Volumen von 2 ml pro Röhrchen).
- Add 50 ul EasySep Negative Selection Maus B-Zell-Enrichment-Cocktail für jeden mL der Zellen. Pipette die Mischung, Kappe der Rohre, und in den Kühlschrank stellen für 15 Minuten.
- 100 l EasySep Biotin Selection Cocktail für jeden mL der Zellen. Pipette die Mischung, Kappe der Rohre, und in den Kühlschrank stellen für 15 Minuten.
- Add 100 L EasySep Magnetische Nanopartikel (sicher Nanopartikel sind gut gemischt und die Lösung homogen ist) für jeden mL der Zellen. Pipette die Mischung, Kappe der Rohre, und in den Kühlschrank stellen für 5 Minuten.
- Top die Lösung bis 2,5 ml mit PBS und in einen EasySep Magnet für 5 Minuten. Kehren Sie die Magnet-und Rohr-und gießen schnell in eine neue Polystyrol-Röhrchen. Schütteln Sie die Röhre als negativ ausgewählten Zellen wird magnetisch auf der Rohrwandungen gebunden zu sein.
- Zur weiteren Erhöhung der Reinheit der Zellsuspension kann das Rohr in den Magneten für weitere 5 Minuten wieder eingesetzt werden und in eine neue Röhre. Dies kann die gesamte Zelle Erholung.
- B-Zell-Reinheit kann durch durchflusszytometrische Analyse der B-Zell-Oberflächenmarker beurteilt werden. Nach Anreicherung wir konsequent sehen einer Reinheit von> 95% B220-positiven Zellen.
Step II: CFSE Zellfärbung
- Resuspendieren der isolierten Zellen in warmen PBS mit 0,1% Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen pro ml ergänzt.
- Bereiten Sie einen 5mm Stammlösung von CFSE (verdünnt in sterile Dimethylsulfoxid) und fügen 2μL für jeden ml der Zellen in die Röhre. Die Endkonzentration von 10 &mgr; m ist optimal für die Färbung von primären B-Zellen.
- Bei 37 ° C für 10 Minuten im Dunkeln (Anmerkung: CFSE ist lichtempfindlich und sollte im Dunkeln, wenn möglich gehalten werden).
- Quench der Fleck durch Zugabe eines gleichen Volumens von bovinem Kälberserum Ihre Zellen und Inkubation auf Eis für 5 Minuten.
- Waschen Sie die Zellen im Rückgriff auf die Röhrchen mit Kulturmedium (siehe Schritt III für Rezept) und Zentrifugation bei 350 g. Beachten Sie, dass mindestens 5-mal das Volumen umgerechnet Medien hinzugefügt werden müssen, um die Viskosität des bovinem Kälberserum entgegenzuwirken und für die Zellen, um ein Pellet zu produzieren.
- Waschen Sie die Zellen noch zweimal in Kulturmedium. Die Zellen sind nun bereit für die Stimulation.
Step III: Cell Stimulation mit LPS
- Bereiten Sie Ihre in vitro B-Zell-Kulturmedium durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum und 50 uM β-Mercaptoethanol /.
- Bereiten Sie Ihre Stimulation Medium durch Zugabe von LPS in einer Endkonzentration von 50μg/mL. Aliquot 125 ul der Stimulation Medium in jede Vertiefung einer Flachboden 96-Well-Gewebekulturplatten.
- Bereiten Sie Ihre CFSE-gefärbte B-Zellen in Kulturmedium ohne LPS in einer Endkonzentration von 3,2 x 10 6 Zellen / ml. Add 125 ul der Zellsuspension in die Vertiefungen mit Ihrem Stimulation mittel-und Mix durch Pipettieren vorsichtig.
- Jedes der gut enthält jetzt 4 x 10 5 Zellen in eine endgültige LPS Konzentration von 25 ug / mL. Dies sorgt für eine optimale Niveau der Zellproliferation und Klassenwechsel, obwohl Änderungen dieser Werte können aus beliebig.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 72 bis 96 Stunden. Nach 48 Stunden wird Cluster von großen proliferierenden B-Zellen deutlich sichtbar unter dem Mikroskop.
Schritt IV: Durchflusszytometrische Analyse der Klassenwechsel
- Wenn Sie bereit sind, bei Klassenwechsel aussehen, entfernen Sie Ihre Zellen von ihrer Kultur Bedingungen und waschen Sie sie zweimal in 1 ml Färbepuffer (PBS mit 2% bovinem Kälberserum).
- Um nicht-spezifische Antikörper-Färbung von Ihren Zellen, Pellet die Zellen durch Drehen sie sich bei 350 g und Gründerzentren verhindernte sie in 100 &mgr; Färbepuffer mit 5% normalem Maus-Serum und 1 g des FcBlock per106 Zellen für 15 Minuten auf Eis. Zellen blockieren sollten auf Eis durchgeführt werden.
- Ohne Waschen Sie Ihre Zellen, fügen 1 g pro 10 6 Zellen eines fluoreszenzmarkierten anti-Maus IgG3-Antikörper und damit die Zellen für 30 Minuten auf Eis Fleck.
- Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugieren und Resuspendieren in 200-300 ul Färbepuffer. Die Zellen sind nun bereit für die Beurteilung mittels Durchflusszytometrie.
- CFSE ist optimal bei 492 nm angeregt (das von einem Argon-Ionen-Laser) und emittiert bei 517 nm. Die Anregungs-und Emissionsspektrum des IgG3-Antikörper ist abhängig von seiner Konjugat Fluoreszenzfarbstoff.
Repräsentative Ergebnisse
Nach magnetische Anreicherung, sollte die Zellsuspension wie eine homogene Population von ununterscheidbar kleine runde Zellen (Abbildung 1A) zu suchen. Nach 48-72 Stunden der Stimulation, wird isolierten Clustern von vergrößerten proliferierenden Zellen deutlich sichtbar (Abbildung 1B). Ein großer Anteil der nicht-proliferierenden Zellen erscheinen klein und körnig, wie sie Apoptose.
CSR kann in der Regel auf der höchsten Ebene zwischen 72 und 96 Stunden nach Stimulation erkannt werden, bevor die meisten der Zellen bis 7 beginnen zu sterben. In diesem Stadium sollten die Zellen eine Reihe von Zellteilungen mit eingeschaltet Zellen, die in der späteren Tochter Zellpopulation unterzogen haben. Ein Vertreter durchflusszytometrischen Grundstück von CFSE Verdünnung und Oberflächenexpression von IgG3 nach 96 Stunden LPS-Stimulation ist in Abbildung 2 zu sehen.
Tabelle 1. Isotyp Wechsel Cocktails. Hinweis: Stimulant Konzentration Werte sind nur Empfehlungen. Titrationen kann notwendig sein.
| Gewünschte Isotyp | Stimulation Cocktail |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) und IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) und IL-4 (10 ng / mL) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) und IFN-γ (10 ng / mL) |
| IgG2b und IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) und IL-5 (1,5 ng / mL) |
Abbildung 1. Isolation und LPS-Stimulation von Milz-B-Zellen. (A) Magnetisch Milz B-Zellen vor LPS-Stimulation angereichert. (B) 48 Stunden nach Stimulation mit 25 pg / ml LPS. Zellen sind als Cluster in einem Hintergrund von Strahlen und apoptotische Zellen gesehen.
Abbildung 2. Proliferation und die Klasse wechseln Rekombination nach 96 Stunden. (A) CFSE Verdünnung für LPS stimulierten Zellen nach 96 Stunden in Kultur. Jeder unabhängige Peak repräsentiert eine Verdünnung in CFSE Fluoreszenz entspricht einem unabhängigen Zellteilung. (B) IgG3 Ausdruck zeigt die Entstehung einer IgG3 positive Bevölkerung nach mehreren Runden der Zellteilung.
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Discussion
Das Protokoll skizzierten bietet einen Standard-Test, um AID Expression und Funktion während des Unterrichts Schalten von primären murinen B-Zellen zu analysieren. Dieses Protokoll verwendet bakterielle LPS zu induzieren Wechsel von IgM zu IgG3, obwohl Änderungen an der Stimulation Medien gemacht zu veranlassen, auf andere Isotypen (zusammengefasst in Tabelle 1 8, 9).
Wir haben festgestellt, dass für noch nicht bekannte Gründe, fetales Kälberserum kann das Niveau der Klasse Wechsel in vitro beobachtet beeinflussen. Entscheidend ist, dass die gleichen Losnummer für alle CSR Experimente verwendet werden, um experimentelle Konsistenz zu gewährleisten. Es kann auch nützlich sein, ein Gremium von fötalem Kälberserum Quellen zu erreichen in vitro Wechselraten optimale Bildschirm. Maus-Stämme können sich auch auf den Grad der Klassenwechsel in vitro 10 zu sehen. Je nach dem Test in Frage, schlecht Switching Mausmodellen, wie der SJL Maus muss ausreichend auf die C57BL / 6 Hintergrund der spürbaren Wechselraten erreichen rückgekreuzt werden.
Step I verzichtet werden, wenn eine reine B-Zell-Kultur nicht erwünscht ist. Die Stimulation einer Mischung von Milzzellen noch induzieren Klassenwechsel, obwohl es in einer größeren Population von apoptotischen non-B-Zellen führen kann. Darüber hinaus muss anschließenden durchflusszytometrischen Analyse sind eine etablierte B-Zell-Marker (zB B220, CD19). Die Reinigung Kit in diesem Protokoll wird durch StemCell Technologies geliefert (siehe Reagenzien Tabelle). Alternate-Kits, die eine negative Anreicherung verwenden kann auch nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
CFSE Fluoreszenz kann sehr intensiv sein und damit jedes Experiment erfordert eine angemessene Entschädigung Steuerung für die durchflusszytometrische Analyse. Darüber hinaus wird CFSE langsam auslaufen von Zellen zu einer Verringerung der Gesamt-Fluoreszenz über die Zeit. Aus diesen Gründen empfiehlt es sich, dass alle Experimente einem unstimulierten CFSE-gefärbten Zellpopulation gehören. Über einen kurzen Zeitraum, so werden diese Zellen statisch bleiben in Kultur und kann somit als eine Ausgleichsregelung für CFSE verwendet werden und die nicht-proliferierenden Zellpopulation zu identifizieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Martin-Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Publikation wird durch einen Zuschuss von der Canadian Institute of Health Research (MOP-89783) unterstützt. AM wird durch einen Canada Research Chair Tier II-Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
