Summary
A seguito di esposizione agli antigeni, sottopopolazioni di cellule B attivate subire un processo noto come ricombinazione interruttore classe (CSR) per la produzione di anticorpi isotipi con distinte funzioni effettrici. Il protocollo descritto in questo rapporto spiega come la RSI può essere indotta e analizzati
Abstract
L'immunità umorale è il ramo del sistema immunitario mantenuto da parte delle cellule B e mediato attraverso la secrezione di anticorpi. Dopo l'attivazione delle cellule B, il locus immunoglobuline subisce una serie di modificazioni genetiche per alterare la capacità di legame e le funzioni effettrici degli anticorpi secreti. Questo processo è evidenziato da un evento di ricombinazione genomica noto come ricombinazione di classe switch (CSR) in cui viene sostituito il valore predefinito di anticorpi IgM isotipo per una delle IgG, IgA o IgE. Ogni isotipo possiede diverse funzioni effettrici rendendo in tal modo la RSI fondamentale per il mantenimento dell'immunità.
Diversificazione del locus immunoglobuline è mediato dalla attivazione degli enzimi deaminasi indotta citidina (AID). Un video che descrive schematicamente questo processo in dettaglio è disponibile online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Attività AID e la via della RSI sono comunemente studiate nella valutazione della funzione delle cellule B e immunità umorale nei topi. Il protocollo descritto in questo rapporto presenta un metodo di isolamento delle cellule B da milza murina e conseguente stimolazione con lipopolisaccaride batterico (LPS) per indurre il passaggio a classe IgG3 (per isotipi anticorpali altri vedi Tabella 1). Inoltre, la colorazione della cellula colorante fluorescente Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) è usato per controllare la divisione cellulare delle cellule stimolate, un processo cruciale per il passaggio isotipo 1, 2.
La regolamentazione degli aiuti e il meccanismo con cui la RSI si sono ancora poco chiari, e quindi test in classe interruttore in vitro forniscono un metodo affidabile per testare questi processi in diversi modelli murini. Questi test sono stati utilizzati in precedenza nel contesto di carenza di gene utilizzando topi knockout 3. Inoltre, in vitro il passaggio delle cellule B può essere preceduto da trasduzione virale di modulare l'espressione genica attraverso knockdown RNA o espressione del transgene 4-6. I dati da questi tipi di esperimenti hanno influenzato la nostra comprensione della attività AID, la risoluzione della reazione della RSI, e di anticorpi-mediata nel topo.
Protocol
Fase I: isolamento delle cellule B della milza attraverso l'arricchimento magnetico
- Topi sperimentali devono essere di età compresa tra 8-12 settimane per garantire la piena maturazione del sistema immunitario.
- Euthanize il mouse dislocazione cervicale e immergersi in etanolo al 70%. Rimuovere chirurgicamente la milza facendo un'incisione attraverso la pelle ei muscoli del ipocondrio sinistro dell'addome e tagliata in tre pezzi grossi in tampone fosfato (PBS). Garantire tutti gli strumenti e reagenti sono sterili.
- Utilizzando la fine di gomma di una siringa da 1 ml stantuffo, poltiglia delicatamente la milza attraverso un filtro 70 micron cellula in PBS. Assicuratevi di utilizzare un movimento di spinta piuttosto che un movimento di rettifica rettifica può portare alla rottura dei più grandi (cioè proliferanti) cellule.
- Spin giù le cellule a non più di 350 g per 5 minuti e risospendere il pellet in PBS. Contare le cellule risospese con un emocitometro.
- Preparare una sospensione di 1x10 8 cellule / ml in PBS con 5% di siero di ratto normale in un tubo sterile 5 ml in polistirolo con un tappo (volume massimo di 2 ml per provetta).
- Aggiungere 50 ml di EasySep negativa cocktail mouse selezione arricchimento cella B per ogni ml di cellule. Pipetta la miscela, tappo i tubi, e mettere in frigo per 15 minuti.
- Aggiungere 100 ul EasySep Cocktail selezione biotina per ogni ml di cellule. Pipetta la miscela, tappo i tubi, e mettere in frigo per 15 minuti.
- Aggiungere 100 ml di EasySep nanoparticelle magnetiche (garantire le nanoparticelle sono mescolati bene e la soluzione è omogenea) per ogni ml di cellule. Pipetta la miscela, tappo i tubi, e mettere in frigo per 5 minuti.
- Top la soluzione a 2,5 ml con PBS e collocare in un magnete EasySep per 5 minuti. Invertire il magnete e tubo e versare subito in una provetta di polistirolo nuovo. Non agitare il tubo come cellule negativamente selezionati verranno magneticamente legato alle pareti del tubo.
- Per aumentare ulteriormente la purezza della sospensione cellulare, il tubo può essere reinserito nel magnete per altri 5 minuti e versato in un nuovo tubo. Questo può ridurre il recupero complessivo delle cellule.
- Purezza delle cellule B può essere valutata mediante citometria a flusso dei marcatori di superficie delle cellule B. A seguito di arricchimento, abbiamo sempre vedere una purezza> 95% di cellule positive B220.
Fase II: colorazione della cellula CFSE
- Risospendere le cellule isolate in caldo PBS integrato con 0,1% di albumina sierica bovina ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule per ml.
- Preparare una soluzione stock di 5mM CFSE (diluita in sterili dimetilsolfossido) e aggiungere 2μL per ogni ml di cellule nel tubo. La concentrazione finale di 10μM è ottimale per la colorazione delle cellule B primarie.
- Incubare a 37 ° C per 10 minuti al buio (nota: CFSE è sensibile alla luce e deve essere conservato al buio, quando possibile).
- Spegnere la macchia con l'aggiunta di un uguale volume di siero di vitello bovini verso le cellule e di incubazione in ghiaccio per 5 minuti.
- Lavare le cellule attraverso un ricorso supplementare i tubi con terreno di coltura (vedi punto III per ricetta) e centrifugazione a 350 g. Si noti che almeno 5 volte l'equivalente volume di mezzi di comunicazione deve essere aggiunto per contrastare la viscosità del siero di vitello e bovino per le cellule di produrre un pellet.
- Lavare le cellule due volte di più nel terreno di coltura. Le cellule sono ora pronti per la stimolazione.
Fase III: la stimolazione delle cellule con LPS
- Preparare il supporto in coltura in vitro delle cellule B, completandola RPMI 1640 con il 10% di siero fetale bovino e 50 mM β-mercaptoetanolo /.
- Preparare il supporto stimolazione con l'aggiunta di LPS ad una concentrazione finale di 50μg/mL. Aliquota 125 ml di mezzo di stimolazione in ciascun pozzetto di un fondo piatto da 96 pozzetti piastra di coltura dei tessuti.
- Preparare il CFSE macchiato di linfociti B nel terreno di coltura senza LPS ad una concentrazione finale di 3,2 x 10 6 cellule / ml. Aggiungere 125 ml di sospensione cellulare ai pozzetti contenenti i media stimolazione e mescolare pipettando delicatamente.
- Ogni ora contiene ben 4 x 10 5 cellule in una concentrazione finale LPS di 25 mg / ml. Ciò fornisce livelli ottimali di proliferazione delle cellule e il passaggio di classe, anche se le modifiche a questi valori possono essere fatte come desiderato.
- Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 72 a 96 ore. Dopo 48 ore, gruppi di grandi cellule B proliferanti sarà chiaramente visibile al microscopio.
Fase IV: L'analisi citofluorimetrica di switching di classe
- Quando si è pronti a guardare il passaggio di classe, rimuovere le cellule dal loro condizioni di coltura e lavarli due volte in 1 ml di tampone colorazione (PBS con il 2% di siero bovino di vitello).
- Per evitare che non specifica colorazione anticorpale delle cellule, agglomerare le cellule facendo girare giù a 350 g e incubate in 100μL di buffer di colorazione con 5% di siero normale mouse e 1μg di FcBlock per106 cellule per 15 minuti in ghiaccio. Il blocco delle cellule deve essere eseguita su ghiaccio.
- Senza lavarsi le cellule, aggiungere 1μg per 10 6 cellule di un tag fluorescente contro topo IgG3 anticorpi e permettono alle cellule di macchia per 30 minuti in ghiaccio.
- Lavare le cellule due volte tramite centrifugazione e risospendere in 200-300 ml di buffer di colorazione. Le cellule sono ora pronti per la valutazione in citometria a flusso.
- CFSE è ottimale eccitata a 492 nm (da un laser a ioni argon) ed emette a 517 nm. Lo spettro di eccitazione ed emissione dell'anticorpo IgG3 dipende dalla sua coniugato con il colorante fluorescente.
Rappresentante Risultati
A seguito di arricchimento magnetica, la sospensione cellulare dovrebbe apparire come una popolazione omogenea di cellule indistinguibili piccoli circolare (Figura 1A). Dopo 48-72 ore di stimolazione, gruppi isolati di cellule proliferanti allargata sarà chiaramente visibile (Figura 1B). Gran parte delle cellule non proliferanti apparirà piccole e granulari come apoptosi.
RSI può normalmente essere rilevata ai massimi livelli tra 72 e 96 ore dopo la stimolazione prima che la maggior parte delle cellule cominciano a morire 7. In questa fase, le cellule devono avere subito una serie di divisioni cellulari con cellule acceso che appaiono nella popolazione dopo cellula figlia. Un diagramma di flusso rappresentante citometria di diluizione CFSE e espressione di superficie di IgG3 dopo 96 ore di stimolazione LPS può essere visto in Figura 2.
Tabella 1. Isotipo commutazione cocktail. Nota: valori di concentrazione stimolanti sono solo raccomandazioni. Titolazioni può essere necessario.
| Isotipo desiderato | Stimolazione Cocktail |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) e IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) e IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) e IFN-γ (10 ng / ml) |
| IgG2b e IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) e IL-5 (1.5 ng / ml) |
Figura 1. Isolamento LPS e la stimolazione delle cellule B della milza. (A) magneticamente arricchito cellule B della milza prima della stimolazione LPS. (B) 48 ore dopo la stimolazione con 25 mg / ml di LPS. Le cellule proliferanti sono visti come i cluster in una di sfondo delle celle sabbiatura e apoptosi.
Figura 2. Proliferazione e di passare ricombinazione classe dopo 96 ore. (A) diluizione CFSE per LPS stimola le cellule dopo 96 ore di cultura. Ogni picco indipendente rappresenta una diluizione della fluorescenza CFSE corrispondente ad una divisione cellulare indipendente. (B) l'espressione IgG3 mostrano l'emergere di una popolazione IgG3 positivo dopo diversi cicli di divisione cellulare.
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Discussion
Il protocollo di cui sopra fornisce un test standard per analizzare l'espressione AID e funzione durante la commutazione di classe delle primarie cellule B murini. Questo protocollo utilizza LPS batterici per indurre il passaggio da IgM a IgG3, anche se le modifiche ai mezzi di stimolazione può essere fatto per indurre il passaggio ad altri isotipi (riassunti nella Tabella 1 8, 9).
Abbiamo notato che, per ragioni ancora sconosciute, siero di vitello fetale possono influenzare il livello di classe di commutazione osservato in vitro. E 'fondamentale che il numero di lotto stesso essere utilizzato per tutti gli esperimenti della RSI per garantire la coerenza sperimentale. Può anche essere utile per lo screening di un gruppo di fonti siero di vitello fetale per raggiungere ottimale dei tassi di switching in vitro. Ceppi di topi può anche influenzare il grado di switching di classe visto in vitro 10. A seconda del saggio in questione, mal di commutazione modelli murini, come il mouse SJL, devono essere sufficientemente backcrossed al C57BL / 6 sfondo di raggiungere apprezzabili tassi di cambiamento.
Io passo può essere omesso se una pura coltura cellulare B non è desiderata. La stimolazione di una miscela di cellule della milza sarà ancora indurre il passaggio di classe, anche se può comportare un numero maggiore di apoptosi delle cellule non-B. Inoltre, l'analisi di citometria di flusso successivo deve comprendere una stabilita marker delle cellule B (ad es B220, CD19). Il kit di depurazione utilizzati in questo protocollo è fornito da Technologies StemCell (vedi tabella reagenti). I kit alternativi che utilizzano un processo negativo di arricchimento può anche essere utilizzato secondo le istruzioni del produttore.
Fluorescenza CFSE può essere molto intenso e quindi ogni esperimento richiede un controllo adeguato compenso per l'analisi di citometria di flusso. Inoltre, CFSE lentamente fuoriuscire delle cellule con una riduzione complessiva di fluorescenza nel tempo. Per queste ragioni, si raccomanda che tutti gli esperimenti includono un stimolate CFSE macchiato di popolazione di cellule. In un breve periodo di tempo, queste cellule rimangono statici nella cultura e può quindi essere utilizzato come controllo compensazione per CFSE e di identificare i non-proliferanti popolazione di cellule.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Siamo grati al laboratorio Martin per utili discussioni. Questa pubblicazione è sostenuta da una sovvenzione da parte del Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM è supportata da un Canada Research Chair Premio Tier II.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
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