Summary
Antijen maruz kalma ardından, aktive B hücreleri alt popülasyonlar farklı efektör fonksiyonları ile antikor isotypes üretmek için sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir süreç geçmesi. Bu raporda açıklanan protokol KSS uyarılan ve nasıl analiz edilebilir açıklıyor
Abstract
Humoral bağışıklık, B hücreleri ve antikor salgılanmasını aracılığıyla tarafından yapılmaktadır bağışıklık sisteminin dalıdır. B hücre aktivasyonu üzerine, immünglobulin lokus bağlama kapasitesi ve salgılanan antikorlar effektör fonksiyonu değiştirmek için bir dizi genetik değişiklikler geçer. Bu süreç olduğu varsayılan IgM, IgG, IgA, veya IgE antikor izotip yerine sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir genomik rekombinasyon olayı tarafından vurgulanır. Her izotip, böylece bağışıklık bakım KSS önemli hale farklı efektör fonksiyonlarına sahiptir.
Immünglobulin lokus çeşitlendirilmesi enzim aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID) aracılığı ile. Bu süreci ayrıntılı olarak açıklayan bir şematik video online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). YARDIM faaliyet ve KSS yolağının genellikle B hücre fonksiyonu ve farelerde humoral bağışıklığın değerlendirilmesi incelenir. Bu raporda açıklanan protokol fare dalak ve sınıf diğer antikor isotypes (bkz. Tablo 1) IgG3 geçiş ikna etmek için bakteriyel lipopolisakkarit (LPS) ile sonraki stimülasyon B hücre izolasyonu bir yöntem sunuyor. Buna ek olarak, floresan hücre boyama boya Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) uyarılan hücreler hücre bölünmesi, anahtarlama 1, 2 izotip için çok önemli bir süreç izlemek için kullanılır.
YARDIM yönetmelik ve KSS oluştuğu mekanizması hala net değildir ve bu nedenle, in vitro sınıf anahtarı tayinlerde bu süreçlerin çeşitli fare modelleri test etmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu testleri daha önce, knockout farelerde 3 kullanarak gen eksikliği bağlamında kullanılmaktadır . Ayrıca, in vitro B hücreleri anahtarlama, RNA demonte veya transgen ifade 4-6 gen ekspresyonu modüle viral transdüksiyon öncesinde olabilir . Deneyler bu tür veriler YARDIM aktivite, KSS reaksiyon çözünürlük ve fare antikor-aracılı bağışıklık anlayışımızı etkiledi.
Protocol
Adım: manyetik zenginleştirme ile dalak B hücreleri izolasyonu
- Deneysel farelerin bağışıklık sisteminin olgunlaşmasını sağlamak için 8-12 hafta arası olmalıdır.
- Servikal dislokasyon fare Euthanize ve% 70 etanol ile ıslatın. Cerrahi karnın sol hypochondrium kas ve deri yoluyla bir kesi yaparak, dalak kaldırmak ve fosfat üç büyük parçalar halinde kesip tamponlu salin (PBS). Tüm alet ve reaktifler steril olduğundan emin olun.
- Lapa hafifçe PBS içine 70 mikron hücre süzgecinden 1 ml şırınga pistonu kauçuk sonu dalak kullanarak. Taşlama büyük (yani prolifere) hücreleri rüptürüne yol açabilir gibi bir itme hareketi yerine taşlama hareket kullandığınızdan emin olun.
- 5 dakika için en fazla 350 g hücreleri aşağı Spin ve pelet PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Hemasitometre kullanarak yeniden süspanse hücre sayımı.
- 1x10 8 hücre / ml PBS içinde bir kap ile 5 ml steril bir polistiren tüp% 5, normal sıçan serumu (tüp başına 2 mL maksimum hacim) ile bir süspansiyon hazırlayın.
- Ml için her hücre EasySep Negatif Seçim Fare B Hücre Zenginleştirme kokteyl 50 mcL ekleyin. Karışımı Pipet, tüpler kap ve 15 dakika boyunca buzdolabında yer.
- Her hücre ml için 100 mcL EasySep Biotin Seçim Kokteyl ekleyin. Karışımı Pipet, tüpler kap ve 15 dakika boyunca buzdolabında yer.
- EasySep Manyetik Nanopartiküller hücrelerin her ml için 100 mcL (nanopartiküller iyice karıştırılır ve çözüm homojen sağlamak) ekleyin. Karışımı Pipet, tüpler kap ve 5 dakika buzdolabına koyun.
- PBS ve 5 dakika için bir EasySep mıknatıs yer 2.5ml Top çözüm. Mıknatıs ve tüp ters çevirin ve hızla, yeni bir polistiren tüp içine dökün. Olumsuz seçilen hücreleri manyetik tüp duvarları bağlı olacak gibi tüp sallamayın.
- Saflık hücre süspansiyonu daha da artırmak için, tüp ek bir 5 dakika için cazibe merkezi haline yerleştirilemeyen ve yeni bir tüp dökülür olabilir. Bu genel hücre kurtarma azaltabilir.
- B hücre saflık, B hücre yüzey belirteçleri akış sitometrik analizi ile tespit edilebilir. Zenginleştirme ardından, biz sürekli olarak>% 95 B220 pozitif hücrelerin bir saflığa bakın.
Adım: II KAKE hücre boyama
- Ml başına 1 x 10 6 hücre bir final konsantrasyonda albumin% 0.1 sığır serumu ile desteklenmiş sıcak PBS içinde izole hücrelerin tekrar
- KAKE (steril dimetil sülfoksit seyreltilmiş) bir 5mM stok solüsyonu hazırlayın ve tüp hücrelerin her ml için 2μL ekleyin. 10μM son konsantrasyonu birincil B hücreleri boyama için en uygunudur.
- 37 inkübe ° C de 10 dakika karanlıkta (not: KAKE ışığa duyarlı ve mümkün olduğunda karanlık tutulmalıdır).
- Sığır buzağı serum eşit miktarda hücrelere ekleyerek 5 dakika buz üzerinde inkübe leke Quench.
- Kültür ortamı ile tüpler g. (tarifi için adım III) tepesi ve 350 santrifüj hücreleri tarafından yıkayın Medyanın en az 5 kat daha hacimli eşdeğer, sığır buzağı serum viskozitesi karşı ve hücreler için bir pelet üretmek için eklenmesi gerektiğini unutmayın.
- Hücrelerin kültür ortamında iki kez daha yıkayın. Hücrelerinin uyarılması için hazırız.
Adım III: LPS ile hücre uyarımı
- % 10 fetal sığır serumu ve 50 mcM β-mercaptoethanol / RPMI 1640 Ürünü in vitro B hücre kültür ortamı hazırlayın.
- 50μg/mL son bir konsantrasyonda LPS ekleyerek stimülasyon orta hazırlayın. Düz dipli her bir kuyunun 96-iyi doku kültürü plakası stimülasyon orta kısım 125 mcL.
- 3.2 x 10 6 hücre / ml son bir konsantrasyonda LPS olmadan KAKE lekeli B hücreleri kültür ortamı hazırlayın. Stimülasyon orta ve hafifçe pipetleme karışım içeren kuyu hücre süspansiyonu 125 mcL ekleyin.
- Her iyi şimdi 25 mcg / mL nihai LPS konsantrasyonu 4 x 10 5 hücreler içerir. Bu değerlerde değişiklikler istediğiniz gibi olsa da bu, hücre çoğalması ve sınıf değiştirme optimal düzeyde sağlar.
- Hücreler 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 72 96 saat. 48 saat sonra, büyük bir hızla çoğalan B hücreleri kümeleri, mikroskop altında açıkça görülebilir.
Adım IV: sınıf anahtarlama Flow sitometrik analizi
- Sınıfı anahtarlama bakmak için hazır olduğunuzda, kendi kültür koşulları hücreleri çıkarmak ve 1 mL boyama tamponu (% 2 büyükbaş buzağı serumu ile PBS) iki kez yıkayın.
- 350 g ve inkübasyon onları aşağı iplik hücreleri, pelet hücreler non-spesifik antikor boyama önlemek için% 5 normal fare serumu ve 15 dakika boyunca buz üzerinde FcBlock per106 hücrelerinin 1μg tampon boyama, 100μL te onları. Hücre engelleme buz üzerinde yapılmalıdır.
- Hücrelerin yıkama olmadan, floresan etiketli anti-fare IgG3 antikor 10 6 hücre başına 1μg eklemek ve izin hücreler 30 dakika boyunca buz üzerinde leke.
- 200-300 mcL boyama tampon santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreler iki kez yıkayın. Hücreler flow sitometri ile değerlendirilmesi için hazırız.
- KAKE 492 nm'de optimal heyecan (argon-iyon lazer) ve 517 nm dalga boyunda yayar. IgG3 antikorunun eksitasyon ve emisyon spektrumu konjuge floresan boya bağlıdır.
Temsilcisi Sonuçlar
Manyetik zenginleştirme sonra, hücre süspansiyonu ayırt edilemeyen küçük dairesel hücreleri (Şekil 1A) homojen bir nüfus gibi görünmelidir. 48-72 saat sonra stimülasyon, genişlemiş hızla çoğalan hücreleri izole salkım (Şekil 1B) açıkça görülebilir. Apoptozis tabi olmayan hızla çoğalan hücrelerin büyük bir kısmı küçük ve granül görünecektir.
KSS normal hücrelerin en çok 7 ölmeye başlamadan önce stimülasyon sonrasında 72 ve 96 saat arasında en yüksek seviyelerde tespit edilebilir. Bu aşamada, hücreleri, hücre bölünmeleri daha sonra kızı hücre popülasyonu görünen anahtarlamalı hücreleri ile bir dizi geçirmiş olmalı. LPS stimülasyon 96 saat sonra IgG3 KAKE seyreltme ve yüzey ekspresyonu bir temsilcisi akış sitometrik arsa Şekil 2'de görülebilir.
Tablo 1: geçiş kokteyller İzotip. Not: Uyarıcı konsantrasyonu değerleri yalnızca tavsiyelerdir. Titrasyonları gerekli olabilir.
| İstenen İzotip | Uyarım Kokteyl |
| IgG1and IgE | LPS (25μg/mL) ve IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG1and IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) ve IL-4 (10 ng / ml) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) ve IFN-γ (10 ng / ml) |
| IgG2b ve IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) ve IL-5 (1.5 ng / ml) |
Şekil 1 İzolasyon ve dalak B hücreleri LPS stimülasyon. (A) Manyetik LPS stimülasyon önce dalak B hücreleri zenginleştirilmiş. (B) 48 saat sonra 25 mg / ml LPS ile uyarılması. Proliferatif hücreler, kumlama ve apoptotik hücrelerin bir arka plan küme olarak görülür.
Şekil 2, 96 saat sonra Silahların Yayılmasının Önlenmesi ve sınıf anahtarı rekombinasyon . (A) LPS için KAKE seyreltme, 96 saat sonra kültür hücreleri uyarılır. Her bağımsız zirve bağımsız bir hücre bölünmesi ile ilgili KAKE floresan bir seyreltme temsil eder. (B) IgG3 ifade, hücre bölünmesinin birkaç tur sonra bir IgG3 pozitif nüfusunun ortaya çıkması gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda özetlenen protokol birincil fare B hücreleri sınıfı anahtarlama sırasında YARDIM ifade ve fonksiyonunu analiz etmek için standart bir tahlil sağlar. Bu protokol, diğer isotypes (Tablo 1 8, 9 özetlenmiştir) geçiş ikna etmek için uyarılması medya değişiklikler yapılabilir, ancak bakteriyel LPS, IgM gelen IgG3 geçiş ikna etmek için kullanır .
Biz henüz bilinmeyen nedenlerden dolayı, fetal buzağı serumu sınıf in vitro gözlenen anahtarlama düzeyini etkileyen belirtti. Bu aynı lot numarası deneysel tutarlılığı sağlamak için tüm KSS deneyler için kullanılması çok önemlidir. Ayrıca, fetal buzağı serumu kaynaklardan in vitro geçiş oranlarının optimum ulaşmak için bir panel ekranı için yararlı olabilir. Fare suşlarının in vitro 10 görülen sınıf geçiş derecesi etkileyebilir. C57BL / 6 arka plan kayda değer bir geçiş oranlarını elde etmek için yeterince backcrossed olmalı, kötü SJL fare, sıçan modellerinde anahtarlama, söz konusu testin bağlı.
Adım saf bir B hücre kültürü istenen değilse atlanabilir. Apoptotik olmayan B hücreleri daha büyük bir nüfus neden olabilir rağmen, dalak hücrelerinin karışımından stimülasyon, sınıf anahtarlama neden olacaktır. Ayrıca, sonraki akım sitometri analizi kurulmuş bir B hücre belirteci (örneğin B220, CD19) içermelidir. Bu protokolde kullanılan temizleme kiti (reaktifler tabloya bakınız) StemCell Teknolojileri tarafından verilir. Olumsuz bir zenginleştirme işlemi Alternatif kitleri da üreticinin talimatlarına göre kullanılan olabilir.
KAKE floresan çok yoğun olabilir ve böylece her bir deney akım sitometri analizi için uygun bir tazminat kontrolü gerektirir. Buna ek olarak, yavaş yavaş, zaman içinde genel floresan bir azalma ile sonuçlanan hücrelerinin KAKE dışarı sızıntı yapar. Bu nedenlerden dolayı, tüm deneyler unstimulated KAKE boyanan hücre popülasyonu yer almasını tavsiye ederiz. Kısa bir süre içinde, bu hücrelerin kültür statik kalacak ve böylece KAKE için bir tazminat kontrol olarak kullanılabilir ve Non-prolifere hücre popülasyonu tespit etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz yararlı tartışmalar için Martin laboratuvara minnettarız. Bu yayın, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MOP-89.783) bir hibe ile desteklenmektedir. PM Kanada Araştırma Başkanı Tier II Ödülü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Bovine Calf Serum | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 Culture Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Rat Anti-Mouse IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
