세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비
Summary
이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.
Abstract
세포외 매트릭스 (ECM)에 세포 부착의 조절은 세포 마이 그 레이션 및 ECM의 리모델링을 위해 필수적입니다. 초점 adhesions은 macromolecular 어셈블리 그 부부 ECM에 수축성 F – 굴지의 cytoskeleton을하고 있습니다. 이 연결은 세포막에 걸쳐 기본 기판에 세포 기계 병력의 전송을 허용합니다. 최근 작품은 ECM의 기계적 성질은 초점 접착력 및 F – 굴지의 형태뿐만 아니라, 세포 분화, 분열, 증식 및 마이 그 레이션 등 다양한 생리 과정을 조절 표시하고 있습니다. 따라서, 세포 배양 기판의 사용이 정확하게 제어 및 ECM 기계적 특성을 조절하기 위해 점점 더 널리 사용 방법이되었습니다.
자기편 세포에 초점 adhesions의 견인 세력을 계량하기 위해 준수 기판은 고해상도 이미지와 방법 칭했다 견인 힘 현미경 (TFM)에서 전산 기술과 함께 사용됩니다. 이 기술은 세포의 수축에 의해 유도 기판 deformations의 로컬 크기와 방향의 측정에 의존하고 있습니다. 찬란 태그 단백질의 고해상도 형광 현미경와 함께, 그것은 견인 세력과 cytoskeletal 조직 및 개조를 상호 연관시킬 수 있습니다.
여기 우리는 세포 수축 측정에 적합합니다 잘 특징, 조정할 수있는 기계 강성과 세포 배양 기판을 만들 목적으로 2 차원, 호환 매트릭스의 준비에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 polyacrylamide의 hydrogels의 제조 등 젤에서 ECM의 단백질 코팅, 젤에 도금 세포 및 재관류 챔버를 사용하여 고해상도 공촛점 현미경을 포함합니다. 또한, 우리는 인용 TFM 프로토콜을 사용하여 세포 세력의 위치와 크기를 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공합니다.
Protocol
Discussion
절차는 전산 추적 루틴 (Sabass 외., 2008)의 구현과 함께, 견인 힘 현미경 (TFM) 실험의 설정을 위해 여기에서 설명한, 마이크론 규모의 공간 해상도 세포 세력의 부량 수 있도록합니다. 실험 프로토콜을 최적화하기 위해서는 ECM의 리간드의 균일한 코팅을 가진 순수하고 균일한 겔 기판을 형성하는 것이 중요합니다. 우리는 아래의 잠재적인 함정을 논의 :
비 균일한 겔 표면 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 셀룰러 견인 세력 (Sabass 외., 2008)의 부량에 사용되는 전산 추적 소프트웨어 울리히 슈바르츠의 실험실을 감사드립니다. 이 작품은 버로우즈 웰컴 경력 수상과 ML Gardel 의료 과학 국립 연구소 서비스 어워드 (5 T32 GM07281) SP 겨울에하는 NIH 원장의 파이 오니아 수상 (DP10D00354)에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
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