В этом видео мы продемонстрируем экспериментальные методы, используемые для изготовления совместимый, внеклеточного матрикса (ECM), покрытых субстратов пригодны для культуры клеток, и которые поддаются тяги силовой микроскопии и наблюдая последствия жесткости ECM на поведение клеток.
Регуляции клеточной адгезии к внеклеточного матрикса (ECM), имеет важное значение для миграции клеток и ECM ремоделирования. Фокусное спайки макромолекулярных сборок, пару сократительной F-актин цитоскелета в ECM. Эта связь позволяет передачу внутриклеточных механическими силами через клеточную мембрану к основной субстрат. Последние исследования показали, механические свойства ECM регулировать координационный адгезии и F-актин морфологии, а также многочисленные физиологические процессы, в том числе дифференцировки клеток, деление, пролиферацию и миграцию. Таким образом, использование подложки клеточной культуры становится все более распространенным методом точно контролировать и модулировать ECM механические свойства.
Для количественной оценки тяговых усилий в фокальных спайки в приверженцем клетки, совместимые подложки используются в сочетании с высокой разрешающей способностью и вычислительной техники в метод называется микроскопии тяговое усилие (TFM). Этот метод основан на измерении местных величину и направление деформации подложки индуцированных сотовой сокращения. В сочетании с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии флуоресцентно меткой белков, можно соотнести цитоскелета организации и ремоделирования с тягой сил.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для подготовки двумерным, совместимый матриц для того, чтобы создать подложку культуре клеток с хорошо характеризуется, перестраиваемый механическую жесткость, которая подходит для измерения сотовой сокращения. Эти протоколы включают изготовление полиакриламидных гидрогелей, покрытие белков ECM на таких гелей, покрытие клеток на гели и высоким разрешением конфокальной микроскопии с использованием перфузионной камере. Кроме того, мы предоставляем репрезентативной выборки данных, свидетельствующих о местоположении и величине сотового сил использованием привел TFM протоколов.
Процедура, описанная здесь для настройки микроскопии тяговое усилие (TFM) эксперимента, а также реализация вычислительной процедуры отслеживания (Sabass и соавт., 2008), дает возможность количественного клеточного силы с микронных пространственным разрешением. Для оптимизации эксперим…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим лаборатории Ульриха Шварца для вычислительных отслеживания программного обеспечения, используемых в количественной оценке сотовых силы тяги (Sabass и соавт., 2008). Эта работа была поддержана Карьера Burroughs Wellcome премии и премии Pioneer NIH директора (DP10D00354) для ML Гардель и научный медицинский Национальный исследовательский Service Award (5 T32 GM07281) для зимних SP.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |