हम एक lentiviral वेक्टर है कि जैसे – उत्तरदायी लीटर के अलावा पास, विकसित किया है, Rev-प्रतिक्रिया (आरआरई) तत्व है कि एक एचआईवी -1 गूंथना और Rev पर निर्भर फैशन में रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते हैं. वेक्टर GFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में एचआईवी नकल की विशिष्ट पहचान परमिट.
एचआईवी उत्तरदायी अभिव्यक्ति वैक्टर के अधिकांश एचआईवी प्रमोटर, लंबे टर्मिनल दोहराने (LTR) पर आधारित हैं. जबकि एक प्रारंभिक एचआईवी प्रोटीन, जैसे के लिए उत्तरदायी, LTR भी सेलुलर सक्रियण राज्यों और स्थानीय chromatin गतिविधि जहां एकीकरण हुआ है उत्तरदायी है. यह उच्च एचआईवी स्वतंत्र गतिविधि में परिणाम कर सकते हैं, और लीटर आधारित रिपोर्टर के निशान एचआईवी पॉजिटिव 1,2,3 कोशिकाओं उपयोगिता सीमित है. यहाँ, हम एक अभिव्यक्ति lentiviral वेक्टर है कि जैसे उत्तरदायी लीटर, कई एचआईवी डीएनए दृश्यों कि Rev-प्रतिक्रिया तत्व और एचआईवी splicing 4,5,6 साइटों में शामिल करने के लिए इसके अलावा में पास का निर्माण किया. सदिश एक lentiviral संवाददाता वायरस में शामिल किया गया था, जीवित कोशिका आबादी में एचआईवी नकल के अति विशिष्ट पता लगाने की अनुमति है. वेक्टर के गतिविधि हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति के द्वारा मापा गया था. इस सदिश के आवेदन के रूप में यहां बताया एक उपन्यास विकल्प जैसे स्वस्थानी पीसीआर या एचआईवी प्रतिजन धुंधला में मौजूदा तरीकों के लिए, दृष्टिकोण, एचआईवी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान प्रदान करता है. वेक्टर भी एचआईवी पॉजिटिव कोशिकाओं को लक्षित बुनियादी या नैदानिक प्रयोग के लिए चिकित्सकीय जीन व्यक्त कर सकते हैं.
पहले विकसित गूंथना निर्भर अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ के रूप में, Rev प्रणाली यहाँ वर्णित है एक विकसित एचआईवी प्रक्रिया के शोषण. Rev निर्भरता का समावेश renders लीटर आधारित अभिव्यक्ति वेक्टर अत्यधिक नकल एचआईवी की उपस्थिति पर निर्भर है. इस सदिश के आवेदन के रूप में यहाँ की सूचना दी, एक रिपोर्टर एचआईवी निर्भर वायरस, एचआईवी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान के लिए एक उपन्यास नया दृष्टिकोण प्रदान करता है. वेक्टर जीवित कोशिकाओं की परीक्षा परमिट, बुनियादी या नैदानिक प्रयोग के लिए किसी भी जीन व्यक्त कर सकते हैं और एक छद्म टाइप lentivirus रूप में सबसे सेल प्रकार और ऊतकों के लिए उपयोग किया है.
The authors have nothing to disclose.
काम के हिस्से में सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान NIAID से YW 1R01AI081568 और दाताओं और 2009 NYCDC एड्स की सवारी के सवार एम. रोजेन और Day2 इंक द्वारा आयोजित की उदार दान के द्वारा समर्थित किया गया
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Biosafety Cabinet | ||||
37°C 5%CO2 incubator | ||||
Flow cytometer | FACSCalibur | |||
Centrifuge | Beckman | Allega™6KR | ||
4°C regrigerator | ||||
-20°C refrigerator | ||||
-80°C refrigerator | ||||
Cell counter | Nexcelom | Cellometer™ AutoT4 | ||
HEK293T cell line | NIH | |||
CEM-SS cell line | NIH | |||
Jurkat cell line J1.1 | NIH | |||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | ||
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | ||
HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | ||
HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | |||
pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | |||
pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | |||
pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | |||
pHCMV-G | ||||
10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | ||
2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | ||
1% paraformaldehy | Sigma Aldrich | 158127 | ||
Bleach | ||||
50ml Falcon tubes | BD Bioscience | 358206 | ||
5ml round bottom tubes | BD Bioscience | 352063 | ||
0.45μM Millipore filter | Millipore | SLHA033SS | ||
0.20μM Millipore filter | Millipore | SLFG85000 | ||
100mm Petri-dish | Sigma Aldrich | CLS430588 | ||
Size-exclusion column (100,000MW cut off) | SartoriuStedim biotech | VS2041 | ||
2ml frozen tube | Axygen | SCT-200 | ||
96-well plate | BD Bioscience | 353227 | ||
1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT- 175-C |