Summary
قمنا بتطوير lentiviral التي تمتلك ناقلات ، بالإضافة إلى LTR تات التي تستجيب ، العنصر رؤيا الاستجابة (RRE) التي يمكن أن تنظم مراسل التعبير الجيني بطريقة HIV - 1 تات وتعتمد على رؤيا. الموجه تصاريح محددة للكشف فيروس نقص المناعة البشرية في تكرار الخلايا الحية عن طريق التعبير عن GFP.
Abstract
وتستند معظم ناقلات التعبير فيروس نقص المناعة البشرية التي تستجيب على مروج للفيروس ، وتكرار محطة الطويلة (LTR). بينما تستجيب لبروتين الفيروس في وقت مبكر ، تات ، وLTR هو أيضا استجابة لدول التنشيط الخلوي والنشاط لونين المحلية حيث التكامل حدث. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نشاط مستقل عن فيروس نقص المناعة البشرية المرتفعة ، وفرضت قيودا على فائدة LTR المستندة إلى الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية مراسل علامة إيجابية 1،2،3. هنا ، وضعنا متجه التعبير lentiviral التي تمتلك ، بالإضافة إلى LTR تات التي تستجيب ، والعديد من تسلسل الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية التي تتضمن عنصر الاستجابة للرؤيا ومواقع الربط 4،5،6 فيروس نقص المناعة البشرية. تأسست الموجه الى فيروس مراسل lentiviral ، مما يتيح الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية محددة للغاية من تكرار السكان في الخلية الحية. وقد تم قياس نشاط ناقلات بواسطة التعبير مضان من البروتين الأخضر (GFP). تطبيق هذه النواقل كما ذكرت هنا يقدم نهجا بديلا للرواية الأساليب القائمة ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية أو PCR الموقع تلطيخ مستضد ، لتحديد الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية. يمكن للناقلات أيضا أن أعرب عن الجينات العلاجية الأساسية للتجريب أو السريرية لاستهداف الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية.
Protocol
1. ترنسفكأيشن من البلازميدات لإنتاج الجسيمات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral
إعداد : ووصف القس تعتمد على ناقلات lentiviral GFP ، PNL - GFP - RRE - SA ، 4،5،6 سابقا. لتجميع الجسيمات إلى الفيروسية ، وكان contransfected البلازميد في HEK293 الخلايا التائية مع HIV - 1 بناء التعبئة والتغليف ، pCMVΔ8.2 (شريطة تتكرم الدكتور Dider Trono) ، وبلازميد يحمل بروتين سكري VSV - G (pHCMV - G) . تم تنفيذ ترنسفكأيشن خارج باستخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم.
إعداد المخازن : 10 X HBS (Hepes التخزين المؤقت مالحة) أعد بحل 5 غرام من Hepes و 8 غم من كلوريد الصوديوم ، 0،37 غرام من بوكل ، 1 غرام من سكر العنب ، 0.103 غرام من الصوديوم هبو 2 4 (اللامائية) في 100 مليلتر من H 2 O. قسامة the10 العازلة HBS X في aliquots مل (1) ومخزن في -20 درجة مئوية. في وقت ترنسفكأيشن ، تحويل 10 X إلى HBS HBS X 2 مع H 2 O (1 : 5 تمييع) ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى ما بين 7،05-7،12. (لمدة 10 مل HBS X 2 ، فإنه يتطلب عادة حوالي 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1M). فلتر تعقيم العازلة HBS 2X التي تمر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر ميليبور. وأدلى CaCl 2 العازلة حل CaCl 2 في Hepes 10 مم إلى تركيز 2M النهائي. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.8 ، تصفية وتعقيم العازلة المحل في 4 درجات مئوية.
الإجراء :
- قبل يوم واحد لترنسفكأيشن والبذور 2 × 10 6 خلايا HEK293T في 100 مم طبق بيتري ، وتنمو الخلايا خلال الليل في 10 مل DMEM FBS 10 ٪ + 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
- في اليوم التالي ، وإزالة الخلايا من طاف واستبدالها مع 5 مل الطازجة DMEM FBS + 10 ٪ ، وخلايا الثقافة بشكل مستمر لمدة 4 ساعات.
- في أنبوب البوليسترين 5 مل ، أضف 480 ميكرولتر العازلة HBS 2X.
- في الثانية 5 مل أنبوب البوليسترين ، إضافة 60 ميكرولتر 2M CaCl 2 العازلة ، بلازميد الحمض النووي ، وترنسفكأيشن TE العازلة (1 ملم تريس ، EDTA 25 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0) إلى وحدة تخزين ما مجموعه 480 ميكرولتر. لكل صحن بيتري ، ينبغي إضافة البلازميدات في نسبة 10 ميكروغرام من PNL - GFP - RRE - SA ، و 7.5 ميكروغرام من pCMVΔR8.3 ، و 2.5 ملغ من pHCMV - G.
- إضافة البلازميد الحمض النووي CaCl 2 نقطه نقطه الخليط في أنبوب HBS 2 X ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وسوف يعجل غرامة النموذج.
- إضافة ميكرولتر 960 من الخليط نقطه نقطه بواسطة ماصة للخلايا. احتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C ، 5 2 ٪ بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي ، إزالة طاف وإضافة 10 مل الطازجة DMEM FBS + 10 ٪ ، واحتضان خلايا باستمرار في 37 ° C CO ، 5 2 ٪ بين عشية وضحاها.
- في 48 ترنسفكأيشن آخر ساعة ، الحصاد الفيروس عن طريق ازالة طاف ونقله في أنابيب معقمة 50 مل. إضافة 10 مل الطازج الطازجة DMEM FBS + 10 ٪ في كل طبق بيتري ، والاستمرار في الثقافة بين عشية وضحاها. تخزين طاف الفيروس في 4 درجات مئوية.
- تواصل الحصاد في آخر 72 ساعة ترنسفكأيشن عن طريق جمع طاف. الجمع بين جميع supernatants ، وأجهزة الطرد المركزي في supernatants في 500 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير وإزالة الحطام الخلية.
- تم جمع طاف وتصفيتها من خلال تصفية 0.22 ميكرومتر ميليبور. وتركز كذلك على الفيروس من خلال الحجم استبعاد الأعمدة.
2. تركيز الجسيمات الفيروسية وتحديد العيار الحجمي الفيروسية
- وتركزت الجسيمات الفيروسية حسب عمود الحجم الاستبعاد (100،000 ميغاواط قطع ، Centricoin). تم تحميل طاف الفيروسي في العمود ، وطرد في 6000 XG عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- وقد تم جمع طاف الفيروسية المركزة ، aliquoted ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تم تحديد عيار عن طريق العدوى الفيروسية من TNF المعاملة ، HIV - 1 إيجابية سترات خط الخلية ، J1.1 7. والخلايا المستزرعة في صفيحة جيدا في 96 2.5 × 5 10 خلايا لكل مل (100 مل حجم الإجمالي) ، واصاب مع 100 مل من المخفف متسلسل VNL - GFP - RRE - SA لمدة أسبوع. قدرت عيار (TCID50) من الجسيمات عن طريق العد الآبار GFP الإيجابية التالية طريقة ريد ومونش 8.
3. بمناسبة HIV - 1 خلايا ايجابي مع الجسيمات Lentiviral ، VNL - GFP - RRE - SA
إعداد : لأول مرة كانت مصابة CD4 T خط الخلية البشرية ، CEM - SS ، مع HIV - 1. إصابة آخر في 48 ساعة ، وكانت superinfected الخلايا التي تحتوي على جزيئات lentiviral ، VNL - GFP - RRE - SA. عدوى التالية ليومين آخرين ، وجرى تحليل GFP إيجابية الخلايا التدفق الخلوي. كعنصر تحكم ، HIV - 1 أصيبوا مماثل المعافين CEM - SS - VNL الخلايا مع GFP - RRE - SA. أعطى فقط HIV - 1 - المصابة CEM - SS ارتفاع الخلايا إلى خلايا GFP ايجابية لكنها ليست مصابة HIV - 1 - SS CEM الخلايا.
الإجراء :
- قبل ساعتين من الإصابة ، إضافة إلى تركيز polybrane النهائي 4 ملغ / مل. عدد الخلايا واتخاذ 2 × 10 5 خلايا لكل العدوى. تصيب الخلايا التي تحتوي على 200 نانوغرام (P24) من HIV - 1 - 3 NL4 لمدة 2 ساعة.
- غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقائق ، resuspendالخلايا في الخلايا 2 × 5 10 / مل ، والثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- عدد الخلايا واتخاذ 2 × 10 5 خلية لكل عدوى VNL - GFP - RRE - SA. إضافة 100 مل من VNL - GFP - RRE - SA واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. غسل الخلايا وresuspend في 2 × 5 10 خلايا / مل.
- إجراء تحليل تدفق الخلوي في 48 عدوى آخر ساعة. وكانت الخلايا المصابة مكعبات ومعلق في paraformaldehede 500 مل 1 ٪ ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، وتحليلها ثم محلل FACScan (بيكتون ديكنسون).
4. ممثل النتائج
إذا تم تنفيذ هذه التجارب بنجاح ، سيتم الكشف عن مجموعة من السكان GFP كبيرة في الخلايا CEM - SS - 1 - فيروس نقص المناعة البشرية المصابة من تدفق عداد الكريات ، في حين ، في السيطرة ، لن تكون الخلايا GFP ايجابية في الكشف عن HIV - 1 المعافين SS - CEM الخلايا.
إذا كان يتم تنفيذها بنجاح التجارب ، والتي تعتمد على ناقلات رؤيا lentiviral ، VNL - GFP - RRE - SA ، سوف تسمح للكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية محددة للغاية من السكان المقيمين في تكرار الخلية ، من خلال قياس مخضر التعبير (GFP) البروتين. في هذا المثال ، تم صبغ تحصد CEM - SS خلايا الفئران مع الأضداد وحيدة النسيلة PE المسمى ضد الماوس CD24 ، HSA ، وتحليلها ثم على تدفق عداد الكريات لكلا هائل سعيد أنعم والتعبير GFP.
الشكل 1. وكما هو موضح هنا ، تم الكشف عن مجموعة من السكان GFP كبير في HIV - 1 - الخلايا المصابة superinfected مع VNL - GFP - RRE - SA (الشكل 1C). في المقابل ، لم يتم اكتشاف خلايا GFP إيجابية في الخلايا إما CEM - SS HIV - 1 غير مصاب دون عدوى lentiviral (الشكل 1A) أو HIV - 1. الخلايا غير المصابة مع عدوى lentiviral (1B الشكل)
Discussion
كما هو الحال مع نواقل في وقت سابق المتقدمة التي تعتمد على التعبير تات ، وصف نظام القس هنا هو استغلال عملية تطور فيروس نقص المناعة البشرية. إدراج رؤيا - التبعية يجعل ناقلات LTR التعبير المستندة تعتمد اعتمادا كبيرا على وجود فيروس نقص المناعة البشرية تكرار. تطبيق هذه النواقل كما ذكرت هنا ، وفيروس نقص المناعة البشرية التي تعتمد على الصحفي ، ويقدم مقاربة الرواية الجديدة لتحديد الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية. الموجه تصاريح دراسة الخلايا الحية ، ويمكن التعبير عن أي الجينات الأساسية للتجريب أو السريرية ، ونتيجة لالفيروسة البطيئة شبه كتبته لديه حق الوصول إلى معظم أنواع الخلايا والأنسجة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل في جزء من دائرة الصحة العامة 1R01AI081568 منحة من NIAID لYW والتبرعات السخية من الجهات المانحة والدراجين من ركوب 2009 NYCDC الإيدز التي نظمتها وشركة روزن M. Day2
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
