Summary
Мы разработали лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, Rev-ответ элементов (РРЭ), которые могут регулируют экспрессию гена-репортера в ВИЧ-1 Tat и Rev-зависимым способом. Вектор разрешения специфической детекции репликации ВИЧ в живых клетках с помощью выражения GFP.
Abstract
Большинство ВИЧ-реагировать векторов экспрессии на основе промоутер ВИЧ, длинный концевой повтор (LTR). Хотя реагировать на ранних белков ВИЧ, Тат, LTR также отзывчив на сотовые состояния активации и локальной активности хроматина, где интеграция произошла. Это может привести к высокой распространенностью ВИЧ-самодеятельность, и ограничил полезность LTR-журналистом, чтобы отметить ВИЧ-положительных клеток 1,2,3. Здесь мы построили выражение лентивирусов вектор, который обладает, в дополнение к Tat проблематику LTR, многочисленные последовательности ДНК ВИЧ, которые включают Rev-ответ элемент и ВИЧ-сайтов сплайсинга 4,5,6. Вектор был включен в лентивирусов вирус репортера, что позволяет очень специфической детекции репликации ВИЧ в живых клеточных популяций. Деятельность вектор измеряли экспрессию белка зеленой флуоресценции (GFP). Применение этого вектора, как сообщили здесь предлагает новый подход альтернативой существующим методам, таким, как на месте ПЦР или ВИЧ-антиген окрашивания, для выявления ВИЧ-положительных клеток. Вектор может также выразить терапевтических генов для основного или клинических экспериментов, чтобы целевая ВИЧ-положительных клеток.
Protocol
1. Трансфекция плазмиды для производства Rev-зависимый лентивирусов Частицы
Установка: Rev-зависимый GFP лентивирусов вектор, НЛП-GFP-РРЭ-SA, был описан ранее 4,5,6. Чтобы собрать в вирусную частицу, плазмиду contransfected в HEK293 Т-клеток с ВИЧ-1 упаковка построить, pCMVΔ8.2 (любезно предоставлены доктором Dider Trono), и плазмиды проведения VSV-G гликопротеин (pHCMV-G) . Трансфекции было проведено с использованием метода фосфата кальция.
Подготовка буферов: 10 х HBS (Hepes солевой буфер) готовили растворением 5 г Hepes, 8 г хлористого натрия, 0,37 г хлорида калия, 1 г декстрозы, 0,103 г Na 2 HPO 4 (безводный) в 100 мл H 2 O. Алиготе the10 X HBS буфер в 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. Во время трансфекции, конвертировать 10 X HBS до 2 х HBS с H 2 O (1: 5 разведение), а также регулирования рН в пределах от 7,05 - 7,12. (На 10 мл 2 х HBS, как правило, требует примерно 50 мкл 1М NaOH). Фильтры стерилизовать 2X буфера HBS, проходя через 0,22 мкм Millipore фильтр. CaCl 2 буфера было сделано путем растворения CaCl 2 в 10 Hepes мМ до окончательного 2М концентрации. Отрегулируйте рН до 5,8, фильтр стерилизуют буфера и хранить при 4 ° C.
Порядок действий:
- За день до трансфекции, семена 2 х 10 6 HEK293T клеток в 100 мм-Петри блюдо, и вырастить клетки на ночь в 10 мл DMEM + 10% ЭТС при 37 ° C, 5% СО 2.
- На следующий день, удалить супернатант из клетки и замените 5 мл свежей DMEM + 10% FBS, непрерывно культуры клеток в течение 4 часов.
- В 5 мл полистирола трубки, добавляют 480 мкл буфера HBS 2X.
- Во второй трубки полистирола 5 мл, добавить 60 мкл 2М CaCl 2 буфера, плазмиды ДНК и трансфекции ТЕ буфера (1 мМ трис, 25 мМ ЭДТА, рН 8,0) в общем объеме 480 мкл. Для каждого Петри блюдо, плазмиды должны быть добавлены в соотношении 10 мкг НЛП-GFP-РРЭ-SA, 7,5 мкг pCMVΔR8.3 и 2,5 мг pHCMV-G.
- Добавить плазмиды ДНК-CaCl 2 смеси по каплям 2 трубками X HBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Мелкий осадок будет форма.
- Добавить 960 мкл смеси по каплям пипеткой к клеткам. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 за одну ночь.
- На следующий день, удалите супернатант и добавить 10 мл свежей DMEM + 10% FBS, и постоянно инкубации клеток при 37 ° С, 5% СО 2 за одну ночь.
- Через 48 часа после трансфекции, урожай вирус удаляя супернатант и передачи его в 50 мл стерильные пробирки. Добавьте свежие 10 мл свежей DMEM + 10% FBS в каждой Петри блюдо и продолжать культуры в одночасье. Магазин вирус супернатант при 4 ° C.
- Продолжайте урожай в 72 часа после трансфекции, собирая супернатант. Смешайте все супернатанты, и центрифуга супернатанты на уровне 500 мкг в течение 15 минут для осаждения и удаления ячейки мусора.
- Супернатант собирали и фильтруют через 0,22 мкм Millipore фильтр. Вирус был также сосредоточен через гель-столбцов.
2. Концентрат вирусных частиц и определить вирусную Титр
- Вирусные частицы были сосредоточены на гель-колонки (100 000 МВт отрезаны, Centricoin). Вирусный супернатант загружается в колонну, и центрифугировали при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 минут.
- Концентрированный вирусных супернатант собирали, аликвоты и хранили при температуре -80 ° C.
- Вирусный титр определяется заражения TNF-лечение, ВИЧ-1 положительных клеточной линии куртка, J1.1 7. Клетки культивировали в 96 ячейках на уровне 2,5 х 10 5 клеток на мл (100 мл общего объема), а также инфицированы 100 мл последовательно разбавлены VNL-GFP-РРЭ-SA в течение недели. Титр (TCID50) частицы оценивалась путем подсчета GFP положительные скважин по методу Рида и Мюнх 8.
3. Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA
Установка: человеческий Т клеток CD4 линии, CEM-SS, впервые инфицированных ВИЧ-1. Через 48 часа после инфекции, клетки superinfected с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA. После суперинфекции в течение еще двух дней, GFP-положительных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. В качестве контроля, ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клетки одинаково инфицированы VNL-GFP-РРЭ-SA. Только ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клетки породили GFP-положительных клеток, но не ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток.
Порядок действий:
- За два часа до инфекции, добавьте polybrane до конечной концентрации 4 мг / мл. Граф клеток и принимать по 2 х 10 5 клеток для каждой инфекции. Инфицировать клетки с 200 нг (p24) ВИЧ-1 NL4-3 в течение 2 часов.
- Стиральная клеток центрифуге при 300 мкг в течение 10 минут, ресуспендируютклетки в 2 х 10 5 клеток / мл и культуры при 37 ° С в течение 48 часов.
- Граф клеток и принимать по 2 х 10 5 клеток на инфекцию VNL-GFP-РРЭ-SA. Добавить 100 мл VNL-GFP-РРЭ-SA и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Вымойте клетки и ресуспендируют в 2 х 10 5 клеток / мл.
- Выполнить анализ проточной цитометрии в 48 часа после суперинфекции. Зараженные клетки осаждали и ресуспендировали в 500 мл 1% paraformaldehede, инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем анализировали на анализаторе FACScan (Becton Дикенсон).
4. Представитель Результаты
Если эксперименты успешно, значительное население GFP будет обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клеток потока цитометр, тогда как в контрольной, GFP-положительных клеток, не будет обнаружена ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток.
Если эксперименты успешно, Rev-зависимый лентивирусов вектор, VNL-GFP-РРЭ-SA, позволит весьма специфической детекции репликации ВИЧ в живую клетку населения, посредством измерения зеленая флуоресценция белка (GFP) выражении. В этом примере собрано CEM-SS клетки окрашивали РЕ-меченого крысиного моноклонального антитела против CD24 мыши, ЧСА, а затем анализировали на проточном цитометре для АСП и GFP выражения.
Рисунок 1. Как показано здесь, значительное население GFP был обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных клеток superinfected с VNL-GFP-РРЭ-SA (рис. 1в). В противоположность этому, GFP-положительных клеток не были обнаружены ни в HIV-1 неинфицированных CEM-SS клеток без лентивирусов суперинфекции (рис. 1а) или ВИЧ-1 незараженных клеток с лентивирусов суперинфекции (рис. 1b).
Discussion
Как и в ранее разработанных Тат-зависимых векторов выражения, система Rev, описанный здесь, эксплуатация процесс эволюционировал ВИЧ. Включение Rev-зависимость оказывает LTR основе вектора экспрессии в значительной степени зависит от наличия репликации ВИЧ. Применение этого вектора, как сообщили здесь, ВИЧ-зависимых репортер вирус, предлагает новый новый подход для выявления ВИЧ-положительных клеток. Вектор позволяет изучение живых клетках, может выразить любой ген для основных или клинических экспериментов, и, как псевдо-типизированных лентивирус имеет доступ к большинству типов клеток и тканей.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при частичной поддержке общественной службы здравоохранения грант 1R01AI081568 из NIAID, чтобы YW и щедрые пожертвования доноров и всадники 2009 Поездка NYCDC СПИД организована М. Розен и Day2 ООО
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
