Summary
We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.
Abstract
De meeste van HIV-responsieve expressie vectoren zijn gebaseerd op de hiv-promotor, de lange terminale herhaling (LTR). Terwijl het reageren op een vroeg stadium van HIV-eiwit, Tat, de LTR ook inspelen op de cellulaire activatie staten en aan de lokale chromatine activiteit waarbij de integratie heeft plaatsgevonden. Dit kan resulteren in een hoge HIV-zelfstandige activiteit, en heeft beperkt het nut van LTR-gebaseerde reporter ter gelegenheid van hiv-positieve cellen 1,2,3. Hier bouwden we een uitdrukking lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, een groot aantal hiv-DNA-sequenties die de Rev-response element en hiv-splicing plaatsen 4,5,6 op te nemen. De vector werd opgenomen in een lentivirale verslaggever virus, waardoor zeer specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cel populaties. De activiteit van de vector werd gemeten door expressie van de groene fluorescentie eiwit (GFP). De toepassing van deze vector, zoals gerapporteerd hier biedt een nieuwe alternatieve benadering van de bestaande methoden, zoals in situ PCR of hiv-antigeen kleuring, aan HIV-positieve cellen te identificeren. De vector kan ook uitdrukken therapeutische genen voor basis-of klinische experimenten aan HIV-positieve cellen te richten.
Protocol
1. Transfectie van plasmiden voor de productie van de Rev-afhankelijke Lentivirale Particles
Set up: The Rev-afhankelijke GFP lentivirale vector, PNL-GFP-RRE-SA, werd eerder 4,5,6 beschreven. Te monteren in een viraal deeltje, werd het plasmide contransfected in HEK293 T-cellen met een HIV-1 verpakking construct, pCMVΔ8.2 (vriendelijk verschaft door Dr Dider Trono), en een plasmide dat het VSV-G-glycoproteïne (pHCMV-G) . De transfectie werd uitgevoerd met behulp van de calciumfosfaat methode.
Voorbereiding van de buffers: 10 X HBS (Hepes gebufferde zoutoplossing) werd bereid door het oplossen van 5 g van Hepes, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g dextrose, 0,103 g Na 2 HPO 4 (watervrij) in 100 ml H 2 O. Aliquot the10 X HBS buffer in 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C. Op het moment van transfectie, zetten de 10 X HBS tot en met 2 X HBS met H 2 O (1: 5 verdunnen) en pas de pH-waarde tussen 7,05 tot 7,12. (Voor 10 ml 2 X HBS, het vereist meestal ongeveer 50 ul van 1 M NaOH). Filter steriliseren van de 2X HBS buffer door het passeren door een 0,22 uM Millipore filter. CaCl 2 buffer werd gemaakt door het oplossen van CaCl 2 in 10 mM Hepes tot een uiteindelijke concentratie van 2M. Breng de pH op 5,8, filter steriliseren van de buffer en bewaar bij 4 ° C.
Procedure:
- Een dag voorafgaand aan transfectie, zaad 2 x 10 6 HEK293T cellen in een 100 mm Petri-schaal, en cellen 's nachts in 10 ml DMEM + 10% FBS groeien bij 37 ° C, 5% CO 2.
- De volgende dag, verwijder supernatans van cellen en te vervangen door 5 ml vers DMEM + 10% FBS, continu cultuur cellen gedurende 4 uur.
- In een 5 ml polystyreen reageerbuis, voeg 480 ul 2X HBS buffer.
- In een tweede 5 ml polystyreen reageerbuis, voeg 60 il 2M CaCl 2 buffer, het plasmide DNA, en transfectie TE-buffer (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) tot een totaal volume van 480 ul. Voor elke Petri-schaal, moet plasmiden worden toegevoegd in de verhouding van 10 ug van PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 ug van pCMVΔR8.3, en 2,5 mg pHCMV-G.
- Voeg de plasmide DNA-CaCl 2 mengsel druppelsgewijs aan de 2 X HBS buis, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Een fijne neerslag zal vormen.
- Voeg de 960 pi van het mengsel druppelsgewijs door pipet naar de cellen. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 's nachts.
- De volgende dag, verwijder het supernatant en voeg 10 ml vers DMEM + 10% FBS, en continu de cellen incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2 's nachts.
- Op 48 uur na transfectie, verzamel dan het virus door het verwijderen van het supernatant en de overdracht van het in 50 ml steriele buizen. Voeg verse 10 ml vers DMEM + 10% FBS in elke Petri-schaal en blijven aan de cultuur 's nachts. Bewaar het virus supernatant bij 4 ° C.
- Blijf na 72 uur na transfectie oogst door het verzamelen van de supernatant. Combineren alle supernatants, en centrifugeer de supernatanten op 500 xg gedurende 15 minuten om pellet en verwijder de celresten.
- Het supernatant werden verzameld en gefilterd door een 0,22 uM Millipore filter. Het virus werd verder geconcentreerd door middel van grootte-uitsluiting kolommen.
2. Concentreren virusdeeltjes en bepalen virale titer
- Virale deeltjes werden geconcentreerd door een grootte-uitsluiting kolom (100.000 MW cut off, Centricoin). Virale supernatant werd geladen in de kolom, en gecentrifugeerd bij 6000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Geconcentreerde virale supernatant werd verzameld, gealiquoteerd, en opgeslagen bij -80 ° C.
- De virale titer werd bepaald door infectie van een TNF-behandeld, HIV-1 positieve Jacket cellijn, J1.1 7. Cellen werden gekweekt in een 96 wells plaat op 2,5 x 10 5 cellen per ml (100 ml totaal volume), en geïnfecteerd met 100 ml serieel verdund VNL-GFP-RRE-SA voor een week. De titer (TCID50) van het deeltje werd geschat door het tellen van de GFP positieve putten volgens de methode van Reed en Muench 8.
3. Markering HIV-1 positieve cellen met de Lentivirale Particle, VNL-GFP-RRE-SA
Opgericht: een menselijke CD4 T-cellijn, CEM-SS, werd voor het eerst geïnfecteerd met HIV-1. Op 48 uur na infectie werden cellen superinfected met de lentivirale deeltjes, VNL-GFP-RRE-SA. Naar aanleiding van superinfectie nog twee dagen werden GFP-positieve cellen geanalyseerd door middel van flow cytometrie. Als een controle, HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen werden op identieke wijze geïnfecteerd met VNL-GFP-RRE-SA. Alleen de HIV-1-geïnfecteerde cellen CEM-SS gaf aanleiding tot GFP positieve cellen, maar niet van de HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen.
Procedure:
- Twee uur voor infectie, voeg polybrane tot een eindconcentratie 4 mg / ml. Tellen cellen en duren 2 x 10 5 cellen voor elke infectie. Cellen infecteren met 200 ng (p24) van HIV-1 NL4-3 voor 2 uur.
- Wassen van cellen door centrifugeren op 300 xg gedurende 10 minuten, resuspenderencellen in 2 x 10 5 cellen / ml, en de cultuur bij 37 ° C gedurende 48 uur.
- Tellen cellen en duren 2 x 10 5 cellen per infectie met VNL-GFP-RRE-SA. Voeg 100 ml van de VNL-GFP-RRE-SA en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. Was de cellen en resuspendeer in 2 x 10 5 cellen / ml.
- Voer flowcytometrie-analyse op 48 uur na superinfectie. Geïnfecteerde cellen werden gepelleteerd en geresuspendeerd in 500 ml 1% paraformaldehede, geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, en vervolgens geanalyseerd op een FACScan analyser (Becton Dickenson).
4. Representatieve resultaten
Als de experimenten met succes uitgevoerd, zal een aanzienlijke GFP bevolking worden gedetecteerd in HIV-1-geïnfecteerde CEM-SS cellen door de flowcytometer, terwijl in de controlegroep, GFP positieve cellen worden niet gedetecteerd in HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen.
Als de experimenten met succes uitgevoerd, de Rev-afhankelijke lentivirale vector, VNL-GFP-RRE-SA, zal toestaan dat de zeer specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cel populaties, door meting van de groene fluorescentie eiwit (GFP) expressie. In dit voorbeeld werden geoogst CEM-SS-cellen gekleurd met een PE-gelabelde rat monoklonaal antilichaam tegen muis CD24, HSA, en vervolgens geanalyseerd op een flowcytometer voor zowel HSA en GFP expressie.
Figuur 1. Zoals hier getoond, een omvangrijk GFP populatie werd ontdekt in HIV-1-geïnfecteerde cellen superinfected met VNL-GFP-RRE-SA (figuur 1c). Daarentegen werden GFP positieve cellen niet gedetecteerd in een HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen zonder lentivirale superinfectie (figuur 1a) of HIV-1 geïnfecteerde cellen met lentivirale superinfectie (Figuur 1b).
Discussion
Net als bij de eerder ontwikkelde Tat-afhankelijke expressievectoren, het Rev-systeem hier beschreven is een exploitatie van een geëvolueerde hiv-proces. De opname van Rev-afhankelijkheid maakt de LTR-based expressievector in hoge mate afhankelijk van de aanwezigheid van replicerende HIV. De toepassing van deze vector zoals gerapporteerd hier, een HIV-afhankelijke reporter virus, heeft een nieuwe nieuwe aanpak van HIV-positieve cellen te identificeren. De vector maakt onderzoek van levende cellen, kunt uitdrukken elk gen voor het basis-of klinische experimenten, en als een pseudo-getypte lentivirus heeft toegang tot de meeste celtypen en weefsels.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door GGD verlenen 1R01AI081568 van NIAID tot YW en door de gulle giften van de donoren en de rijders van de 2009 NYCDC AIDS Ride georganiseerd door M. Rosen en Day2 Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
