Summary
私たちは、から解離初代細胞を調製するための詳細なプロトコルを提供
Abstract
ここでは、 ショウジョウバエの原腸胚からの解離の初代細胞を調製し、培養する方法を説明します。簡単に言えば、大量のは、若くて健康なハエから胚を上演、集め滅菌し、ガラスホモジナイザーを用いて、単一の細胞懸濁液にして物理的に解離されています。培地中の適切な密度で培養プレートまたはチャンバースライドに播種された後、これらの細胞は、さらにそれらの特定の細胞マーカーによって識別することができるいくつかの形態学的に異なる種類の細胞、に分化することができる。さらに、我々は、遺伝子ノックダウンを引き出すために二重鎖（ds）RNAをこれらの細胞を治療するための条件を提示する。 ショウジョウバエ初代細胞の効率的なRNAiは、単純にdsRNAを含有培養培地で細胞を浸すことによって達成される。他の分子、生化学、細胞イメージング解析とともに、効果的なRNAiの摂動を遂行する能力は、特にショウジョウバエ初代細胞、差別化された筋肉や神経細胞に関連するもので答えられるさまざまな質問ができるようになります。
Protocol
1。フライケージの準備
- 例えば32オンスの昆虫のカップとして便利な容器にショウジョウバエを （そのようなオレゴン- Rまたは遺伝子型などの野生型株）成長する。
- 大胚コレクションケージに新しくeclosedハエを転送したり、人口のケージを飛ぶ。
- 〜25℃、湿度〜光12時間と暗12時間のサイクルで65％の同期胚の収集を容易にするための温度と部屋にケージを移動します。
- それらは糖蜜のプレートにストリーク酵母ペーストを殺した供給することによりケージ内のハエを維持する。 2-3日に一度糖蜜プレートを（殺した酵母ペーストで）変更するD.
2。同期胚のコレクション
- 主細胞の準備の日に、1〜2時間プレレイアウト期間貼り殺さ酵母でコーティングWTH新鮮なプレートを飛ぶ餌。
- ちょうど12時間の明暗サイクルの前に、酵母ペーストの最小限の縞新鮮な糖蜜のプレートにあらかじめレイアウトプレートを交換してください。非同期古い胚を含むプレ素人のコレクションを、捨てる。
- 1〜2時間の期間のための胚を収集する
- 5〜6時間にわたって25℃で胚や店舗の比較的同期人口を含むプレート° Cを削除します。胚は、この時点で高度な原腸胚の段階でとなります。
3。胚の回収と洗浄
- 胚は、下部の最高級のメッシュのふるいで収集するように、ウェットブラシでプレートから胚を緩め、そしてふるいの積み上げセットを介してなまぬるい水道水ですすぐ。できるだけ多くの酵母とハエの残骸として削除するには、数分間洗い流してください。
- ヒントは、胚が一面に蓄積するようにふるい、ゆっくりとdechorionationバスケットにふるいからそれらを洗い流してください。
- 胚を乾燥させることなく、組織培養のフードエリアに移動します。
4。胚の均質化と細胞のプレーティング
- 5〜10分間50％（vol / vol）の漂白剤でそれらを浸漬することにより胚を滅菌しdechorionate。 70％（vol / vol）のエタノールでバスケットの壁から胚を洗浄します。また、エタノール処理の前に蒸留水で胚から漂白剤を洗浄する。この時点から以降の胚を滅菌条件下で組織培養フードで処理する必要があります。
- オートクレーブした蒸留水で漂白剤及び/またはエタノールを除去するために徹底的に胚を洗浄します。
- dechorionationステップの間、胚の量に基づいて、室温のM3媒体の適切な音量でダウンスホモジナイザーを埋める。胚の体積の間に、メディアのその比は0.5 mlの胚を超えることはできません：40 mlの培地（または〜100から200まで胚/ ml）を。
- 水没胚のに十分なM3メディアの量を滅菌ビーカーでリンス胚を置きます。胚は2〜5分間浸してみましょう。
- dechorionationバスケットを分解して滅菌ペーパータオルでNitexメッシュが乾燥汚点。
- 滅菌絵筆でホモジナイザーに胚を移す。
- すべての胚が中断されるまで、チューブの底に達することなく緩い乳棒を使用して、短いストロークで軽くホモジナイズ。ゆっくり、しかししっかりと、8個のフルストロークでホモジナイズする。それが上下に移動と乳棒をねじってはいけません。
- 注ぐまたはピペッティングにより、滅菌50mlのコニカル遠心チューブにホモジネートを転送し、チューブをキャップ。
- 40グラム、ペレットに室温組織の破片、大規模な細胞塊と卵黄の膜で10分間遠心する。きれいなチューブに細胞と卵黄を含有する上清を移し、5分間の遠心分離のステップを繰り返します。
- 慎重にペレットに、360グラムで10分間清浄なチューブやスピンに注ぐまたはピペッティングにより細胞を室温に上清を移す。上清を捨てる。培養液10ml中の細胞ペレット（RNAi実験のための無血清培地）を再懸濁します。
- 細胞密度を推定する血球計数器を用いて生細胞を数える。一方、細胞をペレットに4.10を繰り返します。
- 所望の濃度に細胞を再懸濁します。起動するには、1.7〜2.5 × 10 5細胞/ cm 2で1の範囲〜5 × 10 6細胞/ mlとプレートを試してみてください。
5。 384ウェルプレートで培養した細胞のための主要な細胞のRNAi
- 384ウェルプレートにウェルあたり〜250 ngの最終濃度で各ウェルにdsRNAの5μlを分注する。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに異なるdsRNAを含む384ウェルプレートでの無血清M3培地中でウェル当たりの一次細胞を10ml（1〜4x106細胞/ ml）を分注する。また、細胞は、共焦点イメージングのための8ウェルガラスチャンバースライド上で培養することができます。
- 300グラム、室温で1分間プレートを遠心する。 25無血清培地での培養は、細胞℃で22時間または18でC ° 1-2のC D.
- 各ウェルに血清を含む培養液30mlを追加します。 300グラム、室温で1分間プレートを遠心する。
- 〜7日25を追加5の湿度の高い室と文化初代細胞℃でプレートを置きます
- 画像セルは、ライブまたは免疫蛍光染色した後。
6。代表的な結果：
最適な条件で、培養中の細胞は丸い形態と健康になります。文化は小さな細胞の破片を持っており、初期のメッキ後の50〜80％コンフルエントになります。これらの細胞は、長期間培養後形態学的変化を受けることになる。それは通常、完全に25℃に分化する培養中の細胞のために約5-8日かかる℃に良質初代培養は、通常、細胞 - の - の関心が文化の中で区別されているかどうかによって判断される。例えば、一次筋肉細胞は、多くの場合、枝のような形態を持っているし、サルコメアのシリーズで構成される筋原線維状のストライプと多核筋管となる。完全に分化した筋管は、通常、自発的に文化に移動します。対照的に、差別化された一次ニューロンは、それらの細胞体を持つクラスタを形成し、その軸索のケーブルと他のクラスタと接続する。
図1。初代細胞は、培養に播種された後、形態学的変化を受ける
（A）384ウェルプレートのウェルに播種された後、右の初代培養細胞の明視野像。細胞の大部分はラウンドと無傷とうまく区切られている。 （B）初代培養細胞の明視野像めっき後の20時間。初代細胞は、すでに枝のような形態（長い矢印）を持つクラスタ（大きな矢印）と筋肉、この段階で認識することができますを形成する。 （C）5日間めっき後の初代培養の位相コントラスト画像を。文化は、神経細胞の拡張子（小矢印）、神経細胞のクラスター（ビッグ矢頭）と筋肉（中型矢印）で、はるかに高度に見えます。
図2。 dsRNAは治療を受けた初代細胞の例としては、384ウェルプレートで培養
初代細胞はDmef2 - GAL4を運ぶ胚、D42 - GAL4、UAS -水戸- GFPの導入遺伝子、これでDmef2 - GAL4と筋肉と運動神経の水戸- GFPのD42 - Gal4の駆動式、それぞれから単離された。細胞は、lacZの（AC）または膨張（あれば）（DF）のどちらかをターゲットにdsRNAは処理した。主な筋肉と神経細胞の両方は、GFP（A、C、D、F）で見ることができます。白い矢印は神経細胞の拡張子を指している。アクチンのファロイジン染色は（矢頭）のlacZ dsRNAは（BとC）で処理した培養での枝のような筋肉の構造を明らかにするのですが、それdsRNAは（EとF）で処理した培養でのラウンドアップ筋肉の形態。マージされた画像（C、F）で、筋肉は（白矢印）黄色の染色、しかし、赤色の負のショーのニューロンとその拡張されています。
図3。ヒトビトロネクチンコートしたカバーガラスをスライド上で培養した一次筋肉の共焦点顕微鏡写真
主な筋肉はimmunofluorescently抗ショウジョウバエタイチン（KZ）（マージの赤）とし、アクチンのファロイジン（マージの緑）で染色した。トップパネルには、野生型コントロールの筋肉であり、底部のものは、SAL（CG31374）短縮筋節とRNAiの筋肉です。
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Discussion
ショウジョウバエの細胞の初代培養の発達パターンは、一次細胞調製の過程でいくつかの変数が原因の可能性が、大きく異なります。まず第一に、ハエ産卵のために使用される（古い週間以内）と健康（ウイルス性または細菌感染の自由）若いはずです。彼らは無用であり、それらの胚に由来する細胞が分化することができず、わずか1〜2日間、存続するとして、未受精卵または感染した胚は、避けなければならない。第二に、均質化の過程で、それはあまりにも多くの胚を使用するオーバーロードホモジナイザーをすることが重要です。あまりにも多くの胚をホモジナイザーをオーバーロードすると、破片の量と、最終的に細胞分化が損なわれる死細胞の数は、増加の原因となります。最後に、細胞は主細胞の良好な分化を確保するための適切な密度でプレートしてください。我々は、一次電池は高すぎる高密度で最初に播種しているときに神経細胞や筋肉細胞の両方の分化を劇的に低減されることがわかった。
表現型解析のために、384ウェルプレートは、通常より低い倍率でスクリーニングや画像解析のための主要な細胞を成長させるために使用されます。はるかに高い倍率と高い分解能を持つ画像は、共焦点顕微鏡を用いたイメージング、ライブまたは染色された細胞のいずれかに続いてカバーグラスチャンバースライド上で細胞を増殖することによって達成することができます。ほとんどの主要な細胞が接着なので、チャンバースライドのウェルの細胞を増殖するための領域は、細胞の数と各ウェルに必要な培地量の両方の推定のためのガイドラインとして使用してください。さらに、カバーガラスチャンバースライドは、細胞 - の - 興味の分化を可能にするようなヒトビトロネクチンなどの細胞外マトリックス（ECM）タンパク質、ラミニンやIV型コラーゲンで被覆することができる。例えば、主要な筋肉はしかしよくECMコーティングされたカバーガラス上に、非コーティングカバーガラスに悪影響を区別する。最後に、培地、シールドとサンウM3など、通常の培養液から放出される蛍光を減らすために右のイメージを作成する前に、そのようなHL6として、フライ生理食塩水緩衝液に置き換える必要があります。
原則として、このプロトコルは、どのようなホモ接合実行可能と肥沃な変異株から、と、その胚を手動またはGFPの発現に基づいて選別することによって、選択することができるものからのような遺伝子型、、またはExpressとハエから初代培養細胞の調製に使用することができます。組織特異的Gal4の、UAS -遺伝子Xの遺伝子型。他の実験手法と組み合わせることで、このプロトコルは、さまざまな質問に対処することができるように、特にこのようなニューロンや筋肉などの分化した細胞に関連するもの、および培養細胞系で解決することは困難であるだろう。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
JBは、デイモンラニヨンがん研究財団フェローシップDRG - 1716 - 02サポートされていました。 JZは、NIH / NIGMSフェローシップF32 GM082174 - 02によってサポートされていました。 NPは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
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- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
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