Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones
Summary
Ofrecemos un protocolo detallado para la preparación de las células primarias disociada de<em> Drosophil</em> A los embriones. La capacidad de llevar a cabo la efectiva perturbación RNAi, junto con otros métodos de imagen molecular, bioquímica y celular permite una variedad de cuestiones que deben abordarse en<em> Drosophila</em> Células primarias.
Abstract
Aquí se describe un método para la preparación y el cultivo de células primarias disociada de Drosophila embriones gástrula. En resumen, una gran cantidad de embriones de moscas de la escena joven y saludable son recolectados, esterilizados, y luego físicamente disocia en una suspensión de células individuales usando un homogeneizador de vidrio. Después de estar chapada en placas de cultivo o la cámara de diapositivas en una densidad adecuada en medio de cultivo, estas células pueden diferenciarse en más de varios tipos de células morfológicamente distintas, que pueden ser identificados por sus marcadores celulares específicos. Además, se presentan las condiciones para el tratamiento de estas células con doble cadena (ds) RNA para obtener caída de genes. Eficiente ARNi en células Drosophila primaria se logra simplemente impregnando las células en medio de cultivo que contienen dsRNA. La capacidad para llevar a cabo eficaz perturbación RNAi, junto con otros molecular, análisis bioquímicos, imágenes de células, que permiten una variedad de preguntas a ser respondidas en las células de Drosophila primaria, especialmente las relacionadas con musculares diferenciadas y las células neuronales.
Protocol
Discussion
El patrón de desarrollo de los cultivos primarios de células de Drosophila puede variar mucho, posiblemente debido a las diversas variables durante el proceso de preparación de células primarias. En primer lugar, las moscas utilizadas para la puesta de huevos deben ser pequeños (menos de una semana de edad) y sanos (libres de la infección viral o bacteriana). Embriones fertilizados o infectado se debe evitar, ya que son inútiles, y las células derivadas de los embriones que no se puede diferenciar y só…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB fue apoyada por el Damon Runyon Cancer Research Fellowship Foundation DRG-1716-02. JZ fue apoyado por el NIH / NIGMS F32 Fellowship GM082174-02. NP es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
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