Summary
이 프로토콜은 살아있는 쥐 두뇌의 특정 영역에 유전자 구성의 제공이 아닌 바이러스 방법을 설명합니다. 방법은 플라스미드 준비, micropipette 제조, 신생아 쥐 새끼 수술, 구조의 microinjection과로 구성되어 있습니다
Abstract
유전자 변형 동물의 창조는 생체내에 대한 관심의 유전자의 기능을 연구의 표준 방법입니다. 그러나 대부분의 녹아웃이나 유전자 변형 동물은 수정 유전자가 표현하거나 전체 유기체에서 삭제됩니다 이러한 경우에는 가능한하지 않습니다. 또한, 보상 메커니즘의 다양한 종종 어려운 결과를 해석하는 있도록. 보상 효과는 어느 타이밍 유전자 발현이나 transfected 세포의 양을 제한하여 완화된 수 있습니다.
출생 후의 비 심실 microinjection 및 생체내의 electroporation의 방법은 직접 신생아 쥐 두뇌에 대한 관심의 작은 지역으로 유전자, siRNA 또는 염료 분자 타겟으로 배달을 허용합니다. 기존의 심실 사출 기술에 대조적으로,이 방법 이외의 철새 세포 유형의 transfection 수 있습니다. 방법 여기에서 설명한 방식으로 transfected 동물 생체내 이미징이나 급성 뇌 조각에 electrophysiological 실험에서 두 광자에 대한 예를 들어, 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 소개
유전자 변형 동물의 창조 동물 1 생활과 무너지고 질병 메커니즘 2,3뿐만 아니라 세포 4 속성을 조작을위한 유전자 기능 조사의 강력한 방법입니다. 그러나, 절차 따라서 이러한 바이러스 주사 5, electroporation 6과 utero electroporation 7,8에서 신생아 심실 주입과 같은 다른 유전자 전달 방법의 사용을 warranting, 매우 시간이 소요되고 비용이 상당히 힘드는입니다. ; 관심 지역의 지역 표현식 패턴을 만들 가능성, 비 철새 세포 유형의 현장 transfection에, 예를 들어 대뇌 피질 이외의 바이러스 유전자 구조의 사용 : 출생 후의 비 심실 주입과 electroporation의 방법은 장점의 고유 설정을 가지고 astrocytes.
이 비디오에서는, 우리는 CMV 확장기 (pCAG - EGFP) 9 닭고기 베타 굴지 프로 모터에서 향상된 녹색 형광 단백질에 대한 플라스미드 인코딩을 사용하여 신생아 쥐의 뇌에 출생 후의 유전자 전달의 세부 절차를 보여줍니다. 우리는 얇은 유리 pipettes의 제조 및 stereotactic 악기에 microinjector의 조립, 플라스미드 함유 사출 솔루션의 준비를 보여줍니다. 그럼 우리가 사출 및 절차에 대한 집게 전극 및 생체내의 porator의를 사용하여 electroporation에 대해, 수술을 수행에 대한, isoflurane와 쥐 새끼를 anaesthetizing 이야기. 마지막으로, 우리는 간단히 예상 결과 관점 이러한 실험을하는 동안 발생할 수있는 어려움을 논의합니다.
2. Electroporation에 대한 플라스미드 준비
- 우리는 일반적으로 200 μl 얇은 벽 튜브의 플라스미드 주입 용액 10 μl를 준비합니다. 이 솔루션은 여러 가지 실험을 위해 충분합니다.
- 우리는 10X PBS 1 μl (재료 및 장비를 참조) 0,1 % 빠른 그린 수용액 (재료 및 장비를 참조) 1 μl와 플라스미드 솔루션 8 μl를 (재료 및 장비를 참조) 섞는다.
- 사출 솔루션에 플라스미드의 최종 농도는 μg / μl 1 ~ 3해야합니다. 높은 DNA 농도는 유리 모세관의 얇은 팁을 통해 사출 너무 점성되지만 플라스미드 DNA의 낮은 농도는 transfection 효율을 줄일 수 있습니다.
3. 유리 니들 준비
- 유리 피펫의 준비, 우리는 최대 매개 변수를 당기는 난방에 필라멘트와 모세관 borosilicate 유리 (재료 및 장비를 참조)과 수직 전극 유리를 풀러 (재료 및 장비를 참조)을 사용합니다.
- 그런 다음 직경의 팁을 10-20 μm의를 달성하기 위해 종이를 사용하여 피펫의 팁을 휴식.
- 우리는 현미경 목표 아래 팁 직경과 모양을 확인합니다.
4. Microinjector은 조립
- 모세관 얇은 중합체 (재료 및 장비를 참조) 우리는 (재료 및 장비를 참조) 광유와 (과 재료 및 장비를 참조) 약 삼분의 일 10 μl 해밀턴 주사기의 볼륨을 채우기를 사용하여. 공기 방울을 피하십시오!
- 그렇다면 우리는 미네랄 오일과 유리 피펫을 입력하고 해밀턴 주사기에 피펫를 삽입합니다. 공기 방울을 피하십시오!
- 유리 피펫과 주사기는 다음 (재료 및 장비를 참조) 컨트롤러에 연결된 microinjector에 고정됩니다.
- stereotactic 악기 (재료 및 장비를 참조)에 고정 microinjection 설정은 우리가 안전하게 플라스미드 주입 솔루션으로 튜브에 유리 피펫의 팁을 젖어 수 있습니다.
- 팁이 솔루션의 표면을 접촉하면 추가로 1 또는 2mm를 찍어 마이크로 인젝터 컨트롤러를 사용하여 사출 믹스의 약 1 μl로 피펫을 채울.
5. Anaesthetizing 동물
모든 절차를 여기에 소개는 동물 실험에 대한 규제 헬싱키 대학에 따라 수행되었다.
- 각 실험에 대한, 우리는 (재료 및 장비를 참조) isoflurane의 약 2 ML과 가스 기밀 주사기 (재료 및 장비를 참조) 작성하십시오.
- 주사기가 공기 흐름 소스에 연결된 마취 장치 (재료 및 장비를 참조)에 고정보다, 동물 상자와 마스크 stereotactic 설정에 고정.
- 마취 장치에, 우리는 약 250 ML / 분 및 isoflurane 수준 4 %까지로 공기 흐름을 조정합니다.
- 우리는 2~5분에 대한 동물의 상자에 강아지 쥐를 놓습니다.
- 강아지 중지가 이동할 때, stereotactic 설치에 부착된 가열 패드 (재료 및 장비를 참조)에 놓으십시오.
- anaesthetizing 마스크로 강아지의 머리의 주동이의 일부를 놓으십시오.
- 그것은을 위해 5~10분 걸립니다깊은 마취를 입력 펍.
- 꼬리 핀치와 마취의 깊이를 확인하고 2.0-1.5 % 정도로 isoflurane 유입을 감소.
6. 수술, Microinjection 및 Electroporation
- 70 % 에탄올로의 강아지 머리에 피부를 취급.
- 작은 가위 (재료 및 장비를 참조) 얇은 집게를 사용하면 (재료 및 장비를 참조), 그 이마에 강아지의 아저씨로부터 피부를 잘라.
- 옆으로 피부 조각 벤드와 약간 머리와 피부 고정에 대한 두개골의 청각 orifices에 귀 막대를 가져옵니다.
- 쌍안경 현미경을 사용하여, 우리는 두개골에 bregma 지점을 찾습니다.
- stereotactic 좌표를 사용하여 관심 영역을 식별합니다.
- 이 지역 위의 사출 피펫을 위치하고 두개골 표면에 분사 솔루션의 25-50 NL 놓아 그것을 표시합니다.
- 액체가 뚫고 영역에 나타날 때까지 현미경 고속 수술 훈련 (재료 및 장비를 참조)를 사용하여 표시된 지점에 부드럽게하고 신중하게 두개골을 드릴.
- 좋은 전도성을 달성하기 위해 현재의 전도성 젤로 두개골의 측면에 electropotation의 집게 전극을 (재료 및 장비 참조) (재료 및 장비를 볼 수) 이후의 수정 프로그램입니다.
- 작은 탐폰을 사용하여 뚫고 구멍에서 액체 방울 (재료 및 장비를 참조) 제거하고 사출 사이트의 좌표에 따라 구멍에 유리 바늘을 찍어.
- 5-20 NL / 초의 속도로 사출 솔루션의 25-100 NL을 달이다.
- 신속하게 피펫을 제거하고 즉시 electroporate. Electroporation는 1 Hz의 주파수에서 99 V의 50 MS와 진폭의 기간이있는 5 직사각형 펄스를 적용하여 수행됩니다.
- 전극과 귀 바 제거합니다.
- 바보 (재료 및 장비를 참조)과 날카로운 집게, 외과 스레드 (재료 및 장비를 참조)의 조합을 사용하여 피부를 잘라 바느질.
- 마취 후의 복구를 돕기 위해 15-30분에 대한 따뜻한 챔버에 강아지를 놓습니다.
- 다음 강아지 다시는 어머니의 케이지에 넣어.
7. 대표 결과
성공적으로 transfected 세포에 transgene의 표현은 electroporation 후 약 10 시간이 나타납니다, 그리고 그것은 몇 주 동안 안정적으로 유지됩니다.
위에서 설명한대로 우리는 깊은 대뇌 피질 레이어 또는 출생 후의 일 2 (P2) 위스타 랫 새끼의 striatum 지역에 중 플라스미드를 microinjected 및 생체내 electroporation에서 수행했습니다. 뇌 슬라이스 (두께 400 μm의)은 2~6일 후 절단 (P4 - P8) (Hepes은 얼의 밸런스드 소금 솔루션을 버퍼) 차가운 깔끔히 매체 10 vibrotome을 사용 하였다. 이미지 수집은 상온에서 깔끔히 매체 자이스 혈구 Axioplan이 LSM5 파스칼 공촛점 현미경 (자이스 혈구, 독일)를 사용하여 수행되었습니다.
깊은 대뇌 피질의 레이어와 striatum에 주입 사이트는 직경 (그림 1A, B)에서 약 200-300 μm의의 소형 지역에 위치하고 있었다 EGFP을 표현하는 여러 transfected 세포가 포함되어 있습니다. transfected 세포 내에 EGFP 표현 수준은 다른 모양 (그림 1D)와 축삭 번들 (그림 1E)의 쪽이과 dendrites을 포함하여 얇은 세포 프로세스 (그림 1C)의 이미징을 허용하도록 충분히 높습니다. EGFP뿐만 아니라 electroporation 후 세포 생존의 강력한 안정성은 대뇌 피질 터미널 (그림 1 층)로 axons의 말초 부분 (최대 1.5-2 mm까지 세포 기관에서) 추적 허용.
그림 1. (A) 성공적으로 플라스미드 주사 사이트를 delineating P4 랫 두뇌의 striatum 지역에서 세포를 transfected. (B) P5 랫 두뇌의 깊은 피질 층에서 Transfected 세포 (대뇌 피질의 표면 아래 약 1000 μm의). P8 쥐 두뇌의 striatum 지역 (C) transfected 세포. (D) P8 쥐 두뇌의 striatum 지역에서 transfected 세포의 돌기 프로세스, 화살표가 돌기 쪽이 및 filopodia의 다른 유형을 나타냅니다. (E) 부수적인 경로 내에 transfected 세포 Axons. (F) Axons는 P8 쥐의 피질 (화살촉)의 pial 표면에 종료. 스케일 바는 A, B, E와 F에 100 μm의되며 C와 D. 10 μm의
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Discussion
생활 쥐 두뇌에 유전자 전달 방법은 잘 출생 후의 electroporation 6보다 최근 utero electroporation 7,8,11,12에 대한 설립하고 있습니다. 그러나 이러한 방법은 여러 어플 리케이션에 제한 수있는 플라스미드 DNA의 심실 주사를 기반으로합니다. 예를 들어, 이러한 방법은 해마, 대뇌 피질이나 astrocytes 같은 비 철새 세포 유형의 transfection와 같은 특정 뇌 영역에서 세포를 대상으로 허용하지 않습니다. electroporation과 함께 비 심실 분사 먼저 소뇌 뉴런 13로 유전자 전달을 위해 사용되었다. 우리 프로토콜은 쥐 두뇌의 다른 지역에 비 심실 방법의 확장을 보여줍니다. 우리는 우리의 방법 론적 접근 방식이 출생 후의 쥐 뇌에 5 이내에 관심이 제한된 지역에 유전자 전달의 바이러스 방법에 유용한 대안이라고 제안합니다.
현재 방식의 장점에도 불구하고, 몇 가지 어려움은 아래 논의 예상 수 있습니다.
동물의 1.Optimal 연령
가능한 경우, 젊은 신생아 쥐 새끼는 수술 후 transfection의 효능과 강아지 모두 생존을 향상시키는 수단으로 사용해야합니다. 그것이 나이 14에 사용할 수있는 뇌 아틀라스에서 얻은 stereotactic 좌표를 사용하여 두뇌에 reproducibly 특정 지역을 대상으로 어려운로서 우리 손에서 P0 새끼가 너무 작은 수 있습니다. 또한, P0 새끼는 바느질을 방해 수 얇고 부드러운 피부 있습니다. P0 - P2 동물에 비해 P3와 P4는 수술과 stereotactic 조작의 관점에서 가장 편리한 있지만, 그들은 수술 도중에 발작과 호흡 중단이 발생할 수 있습니다 isoflurane 마취에 과민성 있습니다. 따라서 가장 좋은 방법은 수술 중 예측 및 재현성 microinjections 충분히 큰 P1 - P2 쥐 새끼입니다.
microinjection과 2.Possible 문제
솔루션 (25-100 NL)의 작은 볼륨 반대 압력이 미치는 뇌 조직에 얇은 유리 팁을 통해 주입되면, 그것은 공기 방울이나 leakages가 신중하게 피할 것을 중요합니다. 이들을 피하기 위해 실패 transfection 효율에 극적인 감소가 발생할 수 있습니다.
stereotactic 좌표에 대한 3.Precision 제한
stereotactic 좌표의 정밀도에도 불구하고, 그들은 0.3 mm의 재현성 15 제한이 있습니다. 같은 연령과 체중의 동물을 사용하여 우리의 경험에서 그것은 CA1 hippocampal 지역의 재현성 대상으로하기에 충분 0.2-0.1 mm까지이 한도를 줄일 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 비디오 사운드 트랙 녹음, 전투 편대 - EGFP 플라스미드 준비 3D 애니메이션 박사 피터 Blaesse에 대한 이반 Molotkov와 관련하여 도움이 예카 Karelina 감사합니다.
작품은 핀란드의 국제 이동성, 핀란드어 문화 재단과 핀란드의 아카데미의 센터에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | Fine Science Tools | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing micr–lectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting Co. | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting Co. | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | Fine Science Tools | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
References
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