Summary

تسليم الجينات إلى الدماغ الجرذ بعد الولادة من غير البطين حقن البلازميد وElectroporation

Published: September 17, 2010
doi:

Summary

هذا البروتوكول يصف أسلوب غير الفيروسية تسليم يبني الجينية لمنطقة معينة من الدماغ القوارض الحية. الأسلوب يتكون من إعداد البلازميد وتصنيع micropipette ، جراحة الأطفال حديثي الولادة الفئران الجرو ، microinjection للبناء ، و<em> في الجسم الحي</em> electroporation.

Abstract

خلق حيوانات معدلة وراثيا هو مقاربة نموذجية في دراسة وظائف الجينات ذات الأهمية في الجسم الحي. ومع ذلك ، العديد من خروج المغلوب أو حيوانات معدلة وراثيا ليست قابلة للحياة في تلك الحالات حيث يتم التعبير عن الجينات في تعديل أو حذف الكائن الحي كله. علاوة على ذلك ، مجموعة متنوعة من الآليات التعويضية غالبا ما تجعل من الصعب تفسير النتائج. ويمكن التخفيف من آثار التعويضية إما توقيت التعبير الجيني أو الحد من كمية الخلايا transfected.

طريقة microinjection غير البطين بعد الولادة ويسمح في فيفو electroporation التسليم الموجه للجينات ، أو جزيئات سيرنا صبغة مباشرة إلى منطقة صغيرة من الفائدة في الدماغ القوارض الوليد. على النقيض من البطين التقليدية تقنية الحقن ، وهذا الأسلوب يسمح ترنسفكأيشن من أنواع الخلايا غير المهاجرة. ويمكن استخدام الحيوانات transfected عن طريق الأسلوب الموصوفة هنا ، على سبيل المثال ، لفوتون اثنين في التصوير أو في التجارب المجراة على شرائح الكهربية في الدماغ الحادة.

Protocol

1. مقدمة خلق حيوانات معدلة وراثيا هو وسيلة قوية لتحقيق وظائف الجينات في الحيوانات الحية (1) وكشف عن آلية المرض 2،3 فضلا عن التلاعب خصائص الخلايا 4. ومع ذلك ، فإن الإجراء هو شاقة نوعا ما ، الوقت طويلا ومكلفا للغاية ، وي…

Discussion

هي راسخة طرق توصيل الجينات في الدماغ القوارض الذين يعيشون في الرحم لelectroporation 7،8،11،12 ، وفي الآونة الأخيرة ، لelectroporation بعد الولادة 6. ومع ذلك ، تعتمد هذه الأساليب على الحقن داخل البطيني من الحمض النووي البلازميد ، والتي قد يحد من العديد من التطبيقات. على…

Acknowledgements

نشكر ايكاترينا Karelina للمساعدة في تسجيل الموسيقى التصويرية للفيديو ، إيفان Molotkov للرسوم المتحركة 3D ، والدكتور بيتر لBlaesse CAG – EGFP إعداد البلازميد.

وأيد العمل من المنح المقدمة من مركز الحراك الدولي في فنلندا ، ومؤسسة الثقافة الفنلندية وأكاديمية فنلندا.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b  
Borosilicate tube with filament material Sutter Instruments BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008  
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma D1408  
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment FST 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing microelectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson Medical EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma F7252  
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter FDG9623  
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material WPI MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma M8410  
NanoFil Syringe 10 microliter equipment WPI NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent     Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ  
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900  
Stoelting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting 51625 Assembled on stereotaxic instrument. Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment FST 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment WPI UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001  

References

  1. Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
  2. McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer’s disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
  3. Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
  4. Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
  5. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
  6. Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
  7. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  8. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
  10. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  11. Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
  12. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
  13. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
  14. Ashwell, K., Paxinos, G. . Atlas of the Developing Rat Nervous System. , (2008).
  15. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).

Play Video

Cite This Article
Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

View Video