יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי ביטוי<em> Xenopus ביציות</em> על ידי הזרקת RNA שליח. הפתרון תאיים במהלך הקלטות מהדק תיקון נשלטת על ידי מערכת טפטוף.
Abstract
הפרוטוקול המובא כאן נועד לבחון את הפעלת מוליכות גדול, מתח ו-Ca 2 + המופעל K + (BK) ערוצים. הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי ללמוד את מערכת היחסים מבנה פונקציה תעלות יונים אחרים קולטני הנוירוטרנסמיטר 1. ערוצי BK באים לידי ביטוי נרחב ברקמות שונות היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיים רבים, כולל ויסות התכווצות שרירים חלקים, כוונון תדר של תאים שיער הפנימי הסדרת שחרור הנוירוטרנסמיטר 2-6. ערוצי BK מופעלים על ידי שלילת קוטביות הממברנה ועל ידי תאיים Ca 2 + ו – Mg 2 + 6-9. לפיכך, הפרוטוקול נועד כדי לשלוט הן את מתח הממברנה והפתרון תאיים. בפרוטוקול זה, RNA שליח של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) ואחריו 2-5 ימי דגירה על 18 ° C 10-13. תיקוני ממברנה המכילות אחד או מספר ערוצים BK הם נכרת עם תצורה בתוך-out באמצעות מהדק תיקון טכניקות 10-13. הצד תאיים התיקון הוא perfused עם פתרונות הרצוי במהלך ההקלטה, כך הפעלת הערוץ בתנאים שונים ניתן לבדוק. לסיכום, ה-mRNA של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis להביע ערוץ חלבונים על קרום הביצית, מהדק טכניקות תיקון משמשים שיא זרמים הזורמים בצינורות תחת מתח מבוקר פתרונות תאיים.
Protocol
1. הזרקה לתוך ביציות של mRNA הזרק .05-50 ng RNA שליח שהיה עיבד במבחנה לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) באמצעות Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (דראמונד מדעי החברה, מודל 3-000-204). חזור על זריקה על עשרות ביציות עבור כל ה-mRNA. <li style=";text-align…
Discussion
מערכת ביטוי הביצית הוא אידיאלי עבור אפיון אלקטרו של מתח תלויי תעלות יונים בשל הרקע נמוך יחסית של ערוצי אנדוגני. יתר על כן, מכיוון שמדובר במערכת ביטוי חולף, הוא מספק שיטה יעילה של ביצוע מחקר mutagenesis הערוצים הללו. עם זאת, ראוי לציין כי מערכת ביטוי הביצית שונה מזו בתאי יונק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01-R01 HL70393 ו-NS060706 כדי JCJC הוא פרופסור להנדסה ביו רפואית על ט ספנסר אולין הקרן.
Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).