Biology

Prokaryotic 문화 플라스미드 DNA의 유선형 정화

Published: January 5, 2011 doi: 10.3791/2407

Laura Pueschel¹, Hongshan Li¹, Matthew Hymes¹

Summary

이 프로토콜은 효율적으로 병렬에서 설명 및 플라스미드 DNA의 정화를위한 비용 효율적인 대안입니다

Abstract

우리는 prokaryotic 문화에서 시작하고 고순도 DNA로 끝나는, 96 플라스미드 준비를위한 AcroPrep 사전 필터 플레이트의 전체 과정을 설명합니다. 세균성 lysate 통관 및 DNA의 정화를위한 멀티 잘 여과에 따라이 방법은 플라스미드 준비를위한 능률적인 프로세스를 만듭니다. 실리카 기반의 미디어를 포함하는 필터 플레이트는 쉽게 진공 여과 또는 플라스미드 DNA가 감지할 수있을 정도의 수량을 항복하기 위해 원심 분리기에 의해 처리할 수 있습니다. 정량 분석은 정화 플라스미드 DNA가 1.97의 평균 OD _{280분의 260} 비율로 양질의 지속 결정. 전반적으로, 플라스미드 수율은 시퀀싱 및 복제와 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 더 순수한 DNA를 제공합니다. AcroPrep 사전 필터 번호판을 사용하는 이것은 능률적인 방법은, 수동 세미 자동 또는 완전 자동으로 처리 수 있습니다.

Protocol

1. Lysate 통관

E. 그로 37 밤새 적절한 항생제로 Luria의 수프에 깊은 우물을 접시에 원하는 플라스미드 DNA (문화 / 잘 1 ML) · 잡고 C로 변형 대장균 문화.
10 분 5,000 XG에 문화 접시에있는 펠렛 E. 대장균, 다음 가만히 따르다 뜨는.
100 μL Resuspension 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 100 μg / ML RNase A)의 각 펠렛을 Resuspend.
100 μL / 잘 용해 버퍼 (200 MM NaOH, 1 % SDS) 추가하고 2 분 동안 접시 통을 사용하여 발라줍니다.
100 자 / μL 중화 버퍼 (3.0 M의 칼륨 아세테이트, 산도 5.5) 추가하고 2 분 흔들.
설명 판을 lysate로 세포 lysate을 전송합니다.
350 μL 수집 플레이트 및 진공 매니폴드의 하단에 자리 위에 플레이스 DNA 바인딩 플레이트. (그림 1 참조) 진공 매니폴드를 조립.
진공 장치 위에 플레이스 lysate의 명확 플레이트.
HG (0.34 바) 인치 10 진공을 적용하고 DNA 바인딩 플레이트에 여과물를 수집합니다. HG 인치 12보다 큰 진공 청소기를 사용하지 마십시오. (0.41 바).
진공 매니폴드를 분해. 장치의 아래쪽에 넣어 두 ML 폐기물 수집 플레이트.

2. DNA 바인딩

(그림 2 참조) 다기관의 맨 위에 DNA 바인딩 플레이트를 이동합니다.
300 μL / 잘 바인딩 버퍼 (6 M 구아니딘 - HCL)에 추가하고 혼합하고 아래로 피펫.
진공을 적용 [~ 느린 진공에 대한 HG 인치 5 (0.17 바)]와 여과물을 삭제. DNA는 이제 막에 바인딩됩니다.
와시 버퍼 (80 % 에탄올)의 / 음 400 μL로 씻으십시오.
진공을 적용 후 여과액 폐기하십시오. 2 ML 수집 플레이트를 사용하거나 낭비 직접 필터링하는 경우 불필요 폐기하십시오.
한번 세차를 반복합니다.
건조 흡수 타월에 필터 플레이트의 하단에 얼룩.
잔류 알코올의 제거를 위해 5-10분 위해 한번 더 진공 적용됩니다.
에탄올 방울의 제거를 위해 바닥 얼룩.

3. DNA의 용출

70 자 / μL 용출 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 추가합니다. 높은 DNA 농도가 원하는 경우, 볼륨은 50 μL / 음에 줄일 수 있지만, 평균 총 수확량이 낮은 것입니다.
일분 실온에서 접시를 품어.
정화의 DNA는 진공 또는 원심 분리에 의해 eluted 수 있습니다.
진공 방식 : 진공 매니폴드에 플레이스 깨끗한 수집 판 (DNase, RNase 무료). 모든 용출 버퍼 DNA 바인딩 플레이트 통과 때까지 진공 매니폴드 위에 플레이스 필터 플레이트는 1 분 HG (0.5 바) 인치 15 진공을 적용합니다. 정화의 DNA를 (그림 3 참조)를 수집합니다.
원심 분리 방법 : 5 분 동안 1,000 XG에 깨끗한 수집 판과 원심 분리기 위에 플레이스 정화 필터 플레이트.

4. 양적 및 질적 분석

OD _{280분의 260 측정,} DNA를 정화의 농도를 계산합니다.
정화 pDNA의 아가로 오스 겔의 분석을 수행합니다.

5. 대표 결과

E. 대장균이 자료를 시작 파편 감지할 수있을 정도의 감소를 보여 기존의 원심 분리와 팔 AcroPrep 사전 lysate의 명확 필터 플레이트를 사용하여 명확히 lysate. (그림 4).

세 농도에서 플라스미드 DNA는 TE 버퍼로 아군과 AcroPrep 사전 lysate의 명확 필터 플레이트 통과되었다. 플라스미드 DNA 농도의 비교, 사전 및 사후 여과, 쇼는 세 가지 농도 100 % 복구 (그림 5) ~.

명확히 E.에서 DNA의 복구를 입증하기 위해 대장균 lysate, 플라스미드 DNA가 원유 lysate 치솟았어 후 여과하여 명확히했다. 동일한 플라스미드 DNA가 세포 lysate의 다음 여과에 추가되었습니다. 전기는 각 샘플 (그림 6)에서 aliquots에서 수행되었다. 각 샘플에서 유사한 강도의 하나, 명확 밴드는 여과 기반 설명의 단계에서 작은 경우에는 모든 DNA 손실을 보여줍니다.

E.의 문화 pCAT 플라스미드 DNA를 포함하는 대장균은 E.에서 정화되었습니다 대장균은 팔의 350 μL 1 ML의 DNA 바인딩 필터 플레이트뿐만 아니라, 350 μL DNA 바인딩 접시 두 가지 다른 브랜드를 사용 lysates. 제조 업체에서 권장하는 프로토콜에 명시된 바와 같이 모든 purifications이 수행되었다. 가장 높은 DNA 농도와 총 생산량은 팔의 1 ML AcroPrep 사전 DNA 정화 필터 플레이트 (그림 7과 표 2)에서 볼 수 있습니다.

경쟁 W 또한 높은 DNA 농도를 (155 NG / μL)를 보여줍 있지만, 전체 DNA의 수율이 (4.7 μg / 음) 낮은 복구 볼륨으로 인해 가장 낮은이며, ~ 30 μL. 경쟁 M 108에서 DNA의 가장 낮은 농도를 준 5.6 μg / 음의 총 수율과 μL / NG.

한천세 가지 DNA 바인딩 접시에서 pCAT DNA를 정화의 오세 겔 분석 그림 8에 표시됩니다. 각 수집된 샘플 볼륨이 전기하기 전에 복구 볼륨의 차이에 대한 정확한 65 μL로 조정되었습니다. 모든 샘플은 플라스미드 DNA를 supercoiled 보여주지만, 필터 플레이트의 각 DNA의 수율이 달라집니다.

그림 9는 준비 DNA가 supercoiled 양식에 모두 있으며, 유사한 농도를 가지고 보여줍니다.

그림 1. Lysate 자세한 내용을 진공 매니폴드의 조립.

그림 2. DNA 바인딩에 대한 진공 매니폴드의 조립.

그림 3. 진공 용출을위한 진공 매니폴드의 조립.

그림 4. 여과는 샘플 허가를 단순화합니다. 진공 여과 (350 μL AcroPrep 사전 lysate의 명확 필터 플레이트) 또는 전통적인 원심 분리에 의해 명확히 원유 lysate 300 μL의 세중의 샘플. OD ₃₂₀ 설명 전후에 측정.

그림 5. AcroPrep 사전 lysate의 명확 필터 플레이트를 통해 통과 후 pDNA의 전체 복구. 300 μL TE 버퍼는 25, 50 및 100 μg / ML에서 pCAT를 타서. DNA 농도 및 복구, N = 2 전, 여과 후 OD _260에서 계산.

그림 6. 설명 후 pCAT DNA의 복구. 이전이나 이후에 설명 lysate 치솟았어 pUC19 동등한 금액은 다음 TE 버퍼 10에 1을 희석. 1.2 % 아가로 오스 겔 2 μL / 레인로드됩니다.

그림 7. 팔 Acroprep 사전 DNA 경쟁 플레이트보다 구속력이 필터 플레이트 잘마다 높은 플라스미드 DNA를 얻을 수 있습니다. 1 ML (팔와 경쟁 업체의 M) 1.5 ML (경쟁 W)의 야간 문화 표시 DNA 정화 플레이트를 사용하여 pCAT 플라스미드 DNA의 수율 (OD ₂₆₀₎ DH5α. 강판 제조 업체의 권장 프로토콜을 사용하여 정제. 오차 막대는 표준 오류 (N> 6) 나타냅니다.

그림 8. pCAT의 DNA의 아가로 오스 겔 분석 표시된 DNA 바인딩 접시에 정화. 정화 pDNA의 1.2 % 아가로 오스 겔 전기 영동. 세 가지 purifications에서 풀링된 샘플은 eluate는 정화, 희석 1시 10분 후 65 μL 조정. 레인 당 2 μL 일만 했어.

그림 9. 품질 및 원심 분리기 또는 진공 방법을 정화 pDNA 최종 eluate 수집 아가로 오스 겔 전기 영동에 사용하는 경우와 비슷한 순수한 DNA의 복구. AcroPrep 사전 필터 플레이트 제조 업체에서 권장하는 프로토콜은 pDNA 정화에 대한 미행했다. 용리 2 분 HG (0.5 바) 인치 15 오분이나 진공 1,000 XG에서 원심 분리기에 의해 수행되었다.

Discussion

우리는 몇 가지 장점을 내실수 AcroPrep 사전 필터 플레이트의 손쉬운, 간소화된 프로토콜을 설명합니다. 수동 세미 자동, 또는 완전 자동 AcroPrep 사전 형식으로 처리하면이 방법은 최대 플라스미드 DNA의 수율을 제공합니다. lysate 통관 접시에 통합 prefilter도 샘플, 입자의를 포함 높은 수준의 일관성있는 여과를 제공합니다. 보다 빠르고 균일 최소한의 개최 - 최대 볼륨으로 접시에 걸쳐 여과 속도에 판 결과 잘 도형 및 아울렛 팁 기하학은 교차 오염의 우려없이 수신기 플레이트에 샘플을 직접 흐름을 제공합니다. 중요한 AcroPrep 사전 필터 플레이트의 DNA 결합 판의 높은 바인딩 용량 막은 높은 품질의 플라스미드 DNA의 최대 회복에 최적입니다.

Disclosures

이 비디오 문서의 저자는 악기와 비디오 및 텍스트에 등장하는 시약을 생산 팔 생명 과학의 직원입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157