Strömlinjeformad Rening av Plasmid DNA från Prokaryota kulturer

Summary

Detta protokoll är ett kostnadseffektivt alternativ för effektiv parallell klargöranden och plasmid-DNA rening från

Abstract

Vi beskriver hela processen från AcroPrep Advance Filter Plattor för 96 plasmiden förberedelser, från prokaryota kultur och slutar med hög renhet DNA. Baserat på flera bra filtrering för bakteriell lysat clearance och DNA-rening, ger denna metod en strömlinjeformad process för plasmid beredning. Filtrera plattor som innehåller kvarts-baserade media kan lätt bearbetas av vakuum filtrering eller centrifugering för att ge betydande mängder av plasmid-DNA. Kvantitativa analyser bestämma renade plasmid-DNA är genomgående av hög kvalitet med genomsnittet OD _260/280 förhållandet mellan 1,97. Sammantaget plasmid ger erbjuda fler rena DNA för nedströms applikationer, såsom sekvensering och kloning. Denna förenklade metod att använda AcroPrep Advance Filter Plattor möjliggör manuell, halvautomatisk eller helt automatiserad.

Protocol

1. Lysat Utförsäljning

1. Väx E. coli kulturer omvandlas med önskad plasmid-DNA i djupa brunnar (1 ml kultur / brunn) i Luria buljong med lämplig antibiotika över natten vid 37 ° C med skakning.
2. Pellets E. coli i kultur plattan vid 5000 xgi 10 minuter, sedan dekantera supernatanten.
3. Resuspendera varje pelleten i 100 mikroliter resuspension buffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mikrogram / ml RNas A).
4. Tillsätt 100 mikroliter / brunn lyseringsbuffert (200 mM NaOH, 1% SDS) och skaka med platta shaker i 2 minuter.
5. Tillsätt 100 mikroliter / brunn Neutralization Buffer (3,0 m kaliumacetat, pH 5,5) och skaka i 2 minuter.
6. Överföring cell lysat att lysat förtydligande tallrik.
7. Placera DNA-bindande tallrik ovanpå 350 mikroliter samlingen plattan och lägg i botten av vakuum fördelare. Montera vakuum grenrör (se figur 1).
8. Placera lysat förtydligande tallrik ovanpå sugapparater.
9. Applicera vakuum vid 10 tum Hg (0,34 bar) och samla filtratet till DNA-bindande tallrik. Använd inte dammsugare är större än 12 tum Hg. (0,41 bar).
10. Demontera vakuum grenrör. Häll 2 ml avfallsinsamling plattan i botten av apparaten.

2. DNA-bindande

1. Flytta DNA-bindande plattan till toppen av fördelaren (se figur 2).
2. Tillsätt 300 mikroliter / brunn Binding Buffer (6 M Guanidine-HCl) och pipettera upp och ner för att blanda.
3. Tillsätt vakuum [~ 5 tum Hg (0,17 bar) för långsam vakuum] och kasta filtratet. DNA är nu bundna till membran.
4. Tvätta med 400 mikroliter / brunn av tvättbuffert (80% etanol).
5. Tillsätt vakuum, sedan kasta filtratet. Kasta onödig om du använder 2 tallrik mL samling eller filtrering direkt till avfall.
6. Upprepa tvätta en gång.
7. Blot botten filterplattan på absorberande handduk för att torka.
8. Applicera vakuum gång i 5-10 minuter för att säkerställa borttagning av kvarvarande alkohol.
9. Blot botten för att säkerställa borttagning av etanol droppar.

3. DNA Elution

1. Tillsätt 70 mikroliter / brunn Elution buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Om högre DNA-koncentration önskas kan volymen reduceras till 50 ml / bra, men den genomsnittliga totala avkastningen blir lägre.
2. Inkubera plattan vid rumstemperatur i en minut.
3. Renat DNA kan elueras antingen vakuum eller centrifugering.
4. Vakuum metod: Placera rena samlingen platta (DNas, RNas gratis) i vakuum fördelare. Placera filtret tallrik ovanpå vakuum grenrör, tillämpa vakuum vid 15 tum Hg (0,5 bar) under 1 minut tills alla eluering buffert har passerat genom DNA-bindande plattan. Samla renade DNA (se figur 3).
5. Centrifugering metod: Sätt reningsfilter tallrik ovanpå rena samlingen plattan och centrifugera vid 1000 xg under 5 minuter.

4. Kvantitativa och kvalitativa analyser

1. Mät OD _260/280, beräkna koncentrationen av renat DNA.
2. Utför agarosgel analys av det renade pDNA.

5. Representativa resultat

E. coli lysat förtydligas med hjälp av traditionella centrifugering och Pall AcroPrep Advance lysat förtydligande filter Plattor visade märkbar minskning av skräp från utgångsmaterial. (Figur 4).

Plasmid-DNA i tre koncentrationer var spetsade till TE-buffert och passerade genom AcroPrep Advance lysat förtydligande filter plattan. En jämförelse av plasmid-DNA-koncentration, före och efter filtrering, ~ visar 100% återvinning (Figur 5) på alla tre koncentrationer.

För att demonstrera återvinning av DNA från förtydligas E. coli lysat, plasmid DNA spetsades till rå lysat och sedan klargöras genom filtrering. Samma plasmid-DNA inkom cell lysat efter filtrering. Elektrofores utfördes på alikvoter från varje prov (Figur 6). En enda, tydlig band av liknande intensitet från varje prov visar liten eller ingen DNA-förlust vid filtrering-baserade förtydligande steg.

Kulturer av E. coli som innehåller pCAT plasmid-DNA har renats från E. coli lysates med Pall är 350 mikroliter och 1 ml DNA-bindande Filter Tallrikar, liksom två andra märken av 350 mikroliter DNA-bindande plattor. Alla reningar utfördes enligt tillverkarens rekommenderade protokoll. Den högsta DNA-koncentration och totalavkastning sett från Pall är 1 ml AcroPrep Advance DNA reningsfilter platta (Figur 7 och tabell 2).

Även Konkurrent W visar också hög DNA-koncentration (155 ng / l), är den totala DNA ger den lägsta (4,7 mikrogram / brunn) på grund av den låga återställningsvolymen, ~ 30 mikroliter. Konkurrent M gav den lägsta koncentrationen av DNA vid 108 ng / mikroliter med en totalavkastning på 5,6 mikrogram / bra.

AgarOSE gel analys av renat pCAT DNA från tre olika DNA-bindande plåtar visas i Figur 8. Varje samlas provvolymen justerades till 65 mikroliter för att korrigera för skillnader i återställningsvolymen innan elektrofores. Alla prover visar supercoiled plasmid-DNA, men DNA avkastningen från varje filter plattor varierar.

Figur 9 visar preparerat DNA är alla i supercoiled form och har liknande koncentration.

Figur 1. Montering av Vacuum Manifold för lysat förtydligande.

Figur 2. Montering av Vacuum Manifold för DNA-bindande.

Figur 3. Montering av Vacuum Manifold för vakuum eluering.

Figur 4. Filtrering förenklar prov förtydligande. Tre exemplar prover av 300 mikroliter på råolja lysat förtydligats genom vakuumfiltrering (350 mikroliter AcroPrep Advance lysat förtydligande filterplattan) eller traditionella centrifugering. OD ₃₂₀ mätas före och efter förtydligande.

Figur 5. Fullständig återhämtning av pDNA efter passage genom AcroPrep Advance lysat förtydligande filter plattan. 300 mikroliter TE buffert tillsattes pCAT vid 25, 50 och 100 mikrogram / ml. DNA-koncentration och återhämtning beräknas utifrån OD ₂₆₀ före och efter filtrering, N = 2.

Figur 6. Återvinning av pCAT DNA efter förtydligande. Lika mycket pUC19 spetsade till lysat före eller efter förtydligande, utspädd sedan 1 till 10 i TE buffert. Laddade 2 mikroliter / körfält på 1,2% agarosgel.

Figur 7. Högre plasmid-DNA avkastning per bra med pall Acroprep Advance DNA-bindande filterplattan än konkurrenten tallrikar. PCAT plasmid-DNA avkastning (OD ₂₆₀₎ med hjälp av angivna plattor DNA-rening med 1 ml (Pall och Konkurrent M) eller 1,5 mL (Konkurrent W) över natten kultur DH5α. Rening med hjälp av plåt tillverkarens rekommenderade protokoll. Fel staplar anger standardfel (n> 6).

Figur 8. Agarosgel analys av pCAT DNA renas på visade DNA-bindande plattan. 1,2% agarosgelelektrofores av det renade pDNA. Samlingsprover från tre olika reningar, eluatet justeras till 65 mikroliter efter rening, utspädd 1:10. Laddade 2 mikroliter per bana.

Figur 9. Kvalitet och återvinning av rena DNA liknande när centrifug eller vakuum metoder används för slutlig eluatet samling agarosgelelektrofores av det renade pDNA. Tillverkarens rekommenderade protokoll för AcroPrep Advance Filter Plattor följdes för pDNA rening. Eluering utfördes av centrifugera vid 1000 xg under 5 minuter eller vakuum med 15 tum Hg (0,5 bar) i 2 minuter.

Discussion

Vi beskriver en lättköpt, strömlinjeformad protokollet av AcroPrep Plates Advance filter som ger flera fördelar. Denna metod ger maximal plasmid-DNA ger då bearbetas i manuell, halvautomatisk eller helautomatiska format AcroPrep Advance. Ett integrerat förfilter på lysat avslut plattan ger konsekvent filtrering av prover, även de som innehåller höga halter av partiklar. Brunnen geometri av plattan leder till snabbare, mer enhetliga filtrationshastighet över hela plattan med minimal hold-up-volym, och utloppet spetsen geometri ger direkt flödet av prover till mottagare tallrik utan bekymmer korskontaminering. Viktigt är det höga bindningsförmåga membran i DNA-bindande tallrik AcroPrep Advance Filter Plattor optimerad för maximal återvinning av hög kvalitet plasmid-DNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157