RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo's
Summary
RNA-interferentie is bewezen zeer effectief te genfunctie te analyseren in<em> Drosophila</em> Tracheale ontwikkeling. Een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt door Jiang lab naar dsRNA injecteren in vliegen embryo's knockdown genexpressie wordt geïllustreerd. Deze techniek heeft het potentieel voor het screenen van genen die nodig zijn voor weefsels en organen ontwikkeling in<em> Drosophila</em>.
Abstract
Genetische screening is een van de meest krachtige methodes beschikbaar zijn voor het verkrijgen van inzicht in complexe biologische proces 1. In de loop der jaren veel verbeteringen en tools voor genetische manipulatie zijn beschikbaar in Drosophila 2. Al snel na de eerste ontdekking door Frie en Mello 3 dat dubbelstrengs RNA kan worden gebruikt om knockdown de activiteit van individuele genen in Caenorhabditis elegans, RNA interferentie (RNAi) is aangetoond dat een krachtige reverse genetische benadering van genfuncties te analyseren in Drosophila orgel ontwikkeling 4, 5.
Veel organen, zoals long-, nier-, lever-en vaatstelsel, zijn samengesteld uit vertakte netwerken die tubulaire transport vitale vloeistoffen of gassen 6, 7. De analyse van Drosophila tracheale vorming biedt een uitstekend model systeem om de morfogenese van andere buisvormige organen acht te bestuderen. De Berkeley Drosophila genoom project heeft geopenbaard honderden genen die worden uitgedrukt in de tracheale systeem. De studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen van de buis vorming, de uitdaging is om de rol van deze genen te begrijpen in tracheale ontwikkeling. Hier beschreven we een gedetailleerde methode voor het dsRNA injectie in Drosophila embryo tot knockdown individuele genexpressie. Wij hebben met succes neergehaald endogene dysfusion (dys) genexpressie door dsRNA injectie. Dys is een bHLH-PAS eiwit, uitgedrukt in tracheale fusion-cellen, en het is nodig voor tracheale tak fusion 9, 10. dys-RNAi volledig geëlimineerd dys expressie en resulteerde in tracheale fusie defect. Deze relatief eenvoudige methode is een hulpmiddel om genen nodig voor Uw voor tissure en orgel ontwikkeling in Drosophila te identificeren.
Protocol
Discussion
De dsRNA injectiemethode presenteren maakt hier een zeer gevoelige en snelle analyse van gen-functie in Drosophila tracheale ontwikkeling. Deze methode kan mogelijk worden toegepast op genfunctie te analyseren voor de andere weefsels en organen ontwikkeling.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Stephen Crews bedanken voor dysfusion cDNA, Dys antilichaam en w 1118 vliegen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | ||
| Picospritzer III picopump | Parker Precision Fluidics | 051-0500-900 | ||
| Micro-pipettes | Fisher | 21170M | ||
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
- Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
- Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
- Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
