محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

Summary

الكالسيوم هو رسول في كل مكان في الجهاز العصبي ، وضرورية لتحريك الافراج العصبي والتغييرات في قوة متشابك. هنا نظهر تقنية لتحميل كا ^{2 +} - المؤشرات في محطات العصب ذبابة الفاكهة. نظهر أيضا تصنيع أجهزة المطلوبة ، والتأكيد على النقاط الحرجة للنجاح في هذه التقنية.

Abstract

الكالسيوم يلعب أدوارا عدة في الجهاز العصبي ولكن لا شيء أكثر إثارة للإعجاب من حيث الزناد لاطلاق سراح العصبي ، ولا شيء أكثر عمقا من أن رسول ضروري ليونة متشابك التي تدعم التعلم والذاكرة لمزيد من توضيح الأسس الجزيئية للكا ^{2 +} التي تعتمد على آليات متشابك ، لا بد من نموذج النظام على حد سواء ليونة وراثيا ويمكن الوصول إليها من الناحية الفسيولوجية. ذبابة الفاكهة السوداء البطن يوفر مثل هذا النموذج. في هذا النظام ، وراثيا ترميز الفلورسنت المؤشرات المتوفرة لكشف كا ^{2 +} التغيرات في المحطات الطرفية العصبية. ومع ذلك ، فقد تقتصر هذه المؤشرات حساسية للكا ^{2 +} وغالبا ما تظهر استجابة غير خطية. تتلاءم بشكل أفضل المؤشرات لقياس الفلورسنت الاصطناعية كا السريع ^{2 +} التغييرات المرتبطة بالنشاط العصبية. هنا نظهر تقنية لتحميل ديكستران - مترافق الاصطناعية كا ^{2 +} المؤشرات في محطات العصب يرقات ذبابة الفاكهة تعيش في. هناك تركيز خاص على تلك الجوانب من البروتوكول الأكثر أهمية لنجاح هذه التقنية ، مثل كيفية تجنب التصريف الكهرباء الساكنة على طول الأعصاب معزولة ، والحفاظ على الصحة من إعداد أثناء فترات تحميل طويلة ، وضمان بقاء محور عصبي من خلال توفير كا ^{2 +} لتعزيز ختم النهايات محوار مقطوعة. انخفاض تقارب ديكستران - مترافق كا ^{2 +} ، المؤشرات ، مثل fluo - 4 وrhod ، التي تتوفر تظهر إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء في حين تعطيل الحد الأدنى من الكالسيوم قبل المشبكي ^{2 +} الديناميات. ديكستران - اقتران يساعد على منع كا ^{2 +} يجري عزلها المؤشرات في عضيات مثل الميتوكوندريا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على حد سواء لتحميل الأجنة واليرقات والبالغين.

Protocol

1. حدد طبق تشريح النظيفة التي لم تتعرض إلى أي مثبتات.
   
   
2. تشريح يتجول 3 يرقة ذبابة الفاكهة ^{الثالثة} في طور مرحلي متوسطة ذبابة الفاكهة التي تحتوي على الكالسيوم شنايدر ^{2 +} و L - الجلوتامين ، (لا قطع الأعصاب أو أي ألياف العضلات الضرر رقم 7 ، 6 ، 13 أو 12).
   
   
3. حدد ملء كوب - ماصة مع طرف ميكرون 12 (القطر الداخلي).
   
   
4. استخدام حقنة وأنابيب (لتطبيق الضغط السلبي على ماصة) ضمان عدم عرقلة الطرف ماصة.
   
   
5. حدد غرامة البلاستيك ملء - خيوط التي يمكن إدراجها أسفل طول ماصة الزجاج.
   
   
6. رسم ~ 1 سم من 5 ملم ، مترافق ديكستران كا ^{2 +} ، مؤشر إلى خيوط البلاستيك.
   
   
7. قطع كل قطعة الأعصاب.
   
   
8. دعم ماصة على منحدر من شأنها أن تسمح للطرف ماصة من الاقتراب من خط الوسط البطنية من اليرقة تشريح.
   
   
9. رسم نهاية القطع من الجرأة في الجزء No.4 ، دون معسر العصب ، في نهاية ماصة (وتشمل كمية صغيرة من متوسطة شنايدر).
   
   
10. إزالة أنابيب وتضاف خيوط البلاستيك في ماصة حتى نهاية الخيط هو في حدود 50 ميكرون من نهاية قطع العصب (تجنب ملامسة العصب).
    
    
11. إخراج كافية كا ^{2 +} ، مؤشر على العصب المنتهية لزيادة حجم شنايدر المتوسطة بنحو 33 ٪ (التركيز النهائي ينبغي أن يكون <2mm و). هام -- يجب أن تكتمل في غضون 5 دقائق وهذا من قطع العصب.
    
    
12. إعداد مكان في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، بينما يحمل العصبية.
    
    
13. بعد 40 دقيقة إزالة كا ^{2 +} ، مؤشر باستخدام خيوط.
    
    
14. مغادرة ماصة في مكان وملء تماما مع شنايدر المتوسطة الطازجة ، كما سيتم استخدامها لتطبيق هذه النبضات إلى تحفيز الأعصاب.
    
    
15. السماح للكا ^{2 +} ، مؤشر للتوازن في العصب لا يقل عن 60 دقيقة ، ولكن لا أكثر من 4 ساعات ، قبل أن تبدأ كا ^{2 +} التصوير.
    
    
16. شطف مع إعداد المتوسطة الطازجة شنايدر كل 30 دقيقة في حين أنه من equilibrating.
    
    
17. قبل 20 دقيقة من التصوير استبدال شنايدر المتوسطة مع حل NO.6 الدملمف على غرار (HL6 ؛ ماكلويد وآخرون 2002 ، 2003).
    
    
18. يمكن إضافة L - حمض الغلوتاميك أو الغلوتامات HL6 إلى حل في لتوعي 7mM بعد المشبكي مستقبلات الغلوتامات لمنع العصب أثار تقلص العضلات (ماكلويد وآخرون 2004 ؛. Reiff وآخرون 2002 ، 2005).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	G1626