Summary
Il calcio è un messaggero onnipresente nel sistema nervoso, essenziale per innescare il rilascio dei neurotrasmettitori e dei cambiamenti nella forza sinaptica. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento di Ca 2 +-indicatori in terminazioni nervose Drosophila. Abbiamo anche dimostrare fabbricazione degli apparati necessari e sottolineare i punti critici per il successo della tecnica.
Abstract
Il calcio gioca molti ruoli nel sistema nervoso, ma nessuno più impressionante come trigger per il rilascio dei neurotrasmettitori, e nessuno più profonda di come il messaggero essenziali per la plasticità sinaptica, che supporta l'apprendimento e la memoria. Per ulteriormente chiarire le basi molecolari di Ca 2 +-dipendente meccanismi sinaptici, un sistema modello è necessario che sia geneticamente malleabile e fisiologicamente accessibile. Drosophila melanogaster fornisce un tale modello. In questo sistema, gli indicatori fluorescenti geneticamente codificate sono a disposizione per rilevare Ca 2 + variazioni di terminazioni nervose. Tuttavia, questi indicatori hanno limitato la sensibilità al Ca 2 + e mostrano spesso una risposta non lineare. Sintetici indicatori fluorescenti sono più adatti per misurare la rapida Ca 2 + cambiamenti associati con l'attività del nervo. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento destrano coniugato sintetico Ca 2 + indicatori in terminali nervosi larve vivono in Drosophila. Particolare enfasi è posta sugli aspetti del protocollo più critico per il successo della tecnica, come il modo di evitare scariche di elettricità statica lungo i nervi isolato, il mantenimento della salute della preparazione durante i periodi di carico prolungato, e di garantire la sopravvivenza degli assoni, fornendo Ca 2 + per la promozione di tenuta delle terminazioni degli assoni reciso. Bassa affinità destrano coniugato Ca 2 +-indicatori, come fluo-4 e Rhod, sono disponibili che mostrano un elevato rapporto segnale-rumore mentre minimamente disturbare presinaptico Ca 2 + dinamica. Destrano-coniugazione aiuta a prevenire Ca 2 + indicatori essere sequestrato in organuli come i mitocondri. La tecnica di carico può essere applicato anche per le larve, gli embrioni e adulti.
Protocol
- Seleziona un piatto pulito dissezione che non è stato esposto a qualsiasi fissativi.
- Sezionare un errante 3 ° instar larva di Drosophila in Medio Drosophila Schneider contenente Ca 2 + e L-glutamina, (non tagliare qualsiasi nervi o fibre muscolari danno numeri 7, 6, 13 o 12).
- Selezionare una pipetta di vetro riempimento con una punta di 12 micron (diametro interno).
- Utilizzando una siringa e tubo (per applicare una pressione negativa alla pipetta) garantire che la punta della pipetta non sia ostruito.
- Selezionare un riempimento di plastica sottile filamento che possono essere inseriti per tutta la lunghezza della pipetta di vetro.
- Disegnare ~ 1 cm di 5 mM destrano coniugato Ca 2 +-indicatore nel filamento di plastica.
- Tagliare tutti i nervi segmento.
- Sostenere la pipetta su una rampa che consentirà la punta della pipetta di avvicinarsi alla linea mediana ventrale della larva sezionato.
- Disegna la fine di un nervo tagliato a segmento n.4, senza pizzicare il nervo, nella parte finale della pipetta (includere una piccola quantità di mezzo di Schneider).
- Rimuovere il tubo e inserire il filamento di plastica nella pipetta fino alla fine del filamento è all'interno di 50 micron del taglio del nervo (evitare di toccare il nervo).
- Espellere sufficiente Ca 2 +-indicatore sul nervo fine di aumentare il volume del mezzo di Schneider di circa il 33% (concentrazione finale deve essere <2 mm). Importante - Questo deve essere completato entro 5 minuti di tagliare il nervo.
- Mettere la preparazione al buio a temperatura ambiente, mentre i carichi dei nervi.
- Dopo 40 minuti togliere il Ca 2 +-spia con il filamento.
- Lascia la pipetta in posizione e riempirlo completamente con mezzo fresco di Schneider, in quanto questo sarà utilizzato per applicare gli impulsi stimolando il nervo.
- Lasciare che il Ca 2 +-indicatore per equilibrare nel nervo per almeno 60 minuti, ma non più di 4 ore, prima di iniziare Ca 2 +-imaging.
- Sciacquare la preparazione con mezzo fresco di Schneider ogni 30 minuti mentre è equilibrante.
- 20 minuti prima di imaging sostituire medio Schneider con emolinfa-Like No.6 soluzione (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
- Acido L-glutammico o glutammato può essere aggiunto HL6 soluzione a 7 mm per desensibilizzare i recettori del glutammato postsinaptici per evitare nervo-evocato contrazione muscolare (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
