Summary
Le calcium est un messager omniprésent dans le système nerveux, indispensable pour déclencher la libération des neurotransmetteurs et des changements dans la force synaptique. Ici nous démontrons une technique pour le chargement de Ca 2 +-indicateurs dans les terminaisons nerveuses chez la drosophile. Nous démontrons également la fabrication de l'appareillage nécessaire et de souligner les points critiques pour le succès de la technique.
Abstract
Le calcium joue de nombreux rôles dans le système nerveux, mais aucune n'est plus impressionnant que tant que le déclencheur de la libération de neurotransmetteurs, et aucun n'est plus profond que comme le messager essentiel pour la plasticité synaptique qui soutient l'apprentissage et la mémoire. Pour élucider les mécanismes moléculaires de Ca 2 +-dépendante des mécanismes synaptiques, un système modèle est nécessaire à la fois malléable et physiologiquement génétiquement accessibles. Drosophila melanogaster fournit un tel modèle. Dans ce système, génétiquement codés indicateurs fluorescents sont disponibles pour détecter les changements de Ca 2 + dans les terminaisons nerveuses. Cependant, ces indicateurs ont une sensibilité limitée à Ca 2 + et montrent souvent une réponse non-linéaire. Synthétique des indicateurs fluorescents sont mieux adaptés pour mesurer la rapidité de Ca 2 + changements liés à l'activité nerveuse. Ici nous démontrons une technique pour le chargement de dextran conjugué synthétiques Ca 2 + dans les terminaisons nerveuses des indicateurs vivent dans les larves de drosophile. Un accent particulier est mis sur les aspects des protocoles les plus essentiels à la réussite de la technique, telles que la façon d'éviter des décharges d'électricité statique le long des nerfs isolés, le maintien de la santé de la préparation pendant les périodes de chargement prolongées, et assurer la survie des axones en fournissant Ca 2 + de promouvoir des terminaisons axonales étanchéité rompu. Faible affinité dextran conjugué Ca 2 +-indicateurs, tels que fluo-4 et Rhod, sont disponibles, qui montrent un haut rapport signal sur bruit tout en perturbant minimalement présynaptique Ca 2 + dynamique. Dextran-conjugaison permet d'éviter de Ca 2 + indicateurs étant séquestrées dans des organites comme les mitochondries. La technique de chargement peut être appliquée également aux larves, les embryons et les adultes.
Protocol
- Sélectionnez un plat de dissection propre qui n'a pas été exposé à aucun fixateurs.
- Disséquer une errance 3 e stade larvaire larve de drosophile moyen Drosophila de Schneider contenant Ca 2 + et L-glutamine, (ne pas couper les nerfs ou les fibres musculaires des dommages n ° 7, 6, 13 ou 12).
- Sélectionnez un verre remplissage pipette avec une pointe de 12 microns (diamètre interne).
- En utilisant une seringue et des tubes (pour appliquer une pression négative à la pipette) s'assurer que la pointe de la pipette n'est pas obstrué.
- Sélectionner un plastique fin remplissant-filaments qui peuvent être insérés sur la longueur de la pipette en verre.
- Dessine ~ 1 cm de 5 mM dextran conjugué Ca 2 +-indicateur dans le filament de plastique.
- Couper tous les nerfs du segment.
- Soutien de la pipette sur une rampe qui permettra à la pointe de la pipette à l'approche de la ligne médiane ventrale de la larve disséquée.
- Dessinez l'extrémité coupée d'un nerf de segmenter No.4, sans pincement du nerf, dans l'extrémité de la pipette (inclure une petite quantité de milieu de Schneider).
- Retirer le tube et insérez le filament en plastique dans la pipette jusqu'à la fin du filament est à moins de 50 microns de l'extrémité coupée du nerf (éviter de toucher le nerf).
- Ejecter suffisamment de Ca 2 +-indicateur sur la terminaison nerveuse d'augmenter le volume du milieu de l'Schneider d'environ 33% (concentration finale devrait être <2 mm). Important - Ce doit être complété dans les 5 minutes de couper le nerf.
- Placer la préparation dans le noir à température ambiante pendant le chargement du nerf.
- Après 40 minutes retirer le Ca 2 +-indicateur en utilisant le filament.
- Laisser la pipette en place et le remplir complètement d'un milieu frais de Schneider, comme cela va être utilisé pour appliquer des impulsions stimulant le nerf.
- Laisser le Ca 2 +-indicateur de s'équilibrer dans le nerf pendant au moins 60 minutes, mais pas plus de 4 heures, avant de commencer Ca 2 +-imagerie.
- Rincer la préparation avec un milieu frais Schneider toutes les 30 minutes alors qu'il est équilibrante.
- 20 minutes avant de remplacer l'imagerie milieu de Schneider avec hémolymphe-Like No.6 solution (HL6; MacLeod et al, 2002;. 2003).
- L-acide glutamique ou glutamate peut être ajouté à HL6 solution à 7mm de désensibiliser les récepteurs du glutamate postsynaptique pour empêcher les nerfs évoqué la contraction musculaire (MacLeod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
