Summary
Calcium is een alomtegenwoordige boodschapper in het zenuwstelsel, essentieel voor het activeren van vrijkomen van neurotransmitters en veranderingen in de synaptische sterkte. Hier laten we zien een techniek voor het laden van Ca 2 +-indicatoren in Drosophila zenuwuiteinden. We tonen ook aan de fabricage van de benodigde apparatuur en benadrukken punten van cruciaal belang voor het succes van de techniek is.
Abstract
Calcium speelt vele rollen in het zenuwstelsel, maar niemand meer indrukwekkend dan als de trigger voor neurotransmitter release, en niemand meer diepgaand dan als de boodschapper van essentieel belang voor de synaptische plasticiteit dat leren en het geheugen ondersteunt. Om verder ophelderen van de moleculaire onderbouwing van Ca 2 +-afhankelijke synaptische mechanismen, is een model-systeem vereist dat zowel genetisch kneedbaar en fysiologisch toegankelijk. Drosophila melanogaster voorziet in een dergelijk model. In dit systeem, genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren zijn beschikbaar om Ca 2 + de opsporing van wijzigingen in de zenuwuiteinden. Echter, deze indicatoren beperkt de gevoeligheid voor Ca 2 + en vertonen vaak een non-lineaire respons. Synthetische fluorescerende indicatoren zijn beter geschikt voor het meten van de snelle Ca 2 + veranderingen die gepaard gaan met de activiteit van de nervus. Hier laten we zien een techniek voor het laden van dextran-geconjugeerde synthetische Ca 2 +-indicatoren in live zenuwuiteinden in Drosophila larven. Bijzondere nadruk wordt gelegd op die aspecten van het protocol het meest kritisch voor het succes van de techniek, zoals hoe je statische elektriciteit ontladingen te voorkomen langs de geïsoleerde zenuwen, het handhaven van de gezondheid van de voorbereiding tijdens lange laad-periodes, en te zorgen voor axon overleven door het verstrekken van Ca 2 + het bevorderen van afdichten van afgehakte axon einde. Lage affiniteit dextran-geconjugeerd Ca 2 +-indicatoren, zoals fluo-4 en Rhod, zijn beschikbaar die een hoge signaal-ruisverhouding zien, terwijl minimaal te verstoren presynaptische Ca 2 + dynamiek. Dextran-conjugatie helpt te voorkomen dat Ca 2 +-indicatoren worden afgezonderd in de organellen, zoals mitochondriën. De laad-techniek kan ook toegepast worden op larven, embryo's en volwassenen.
Protocol
- Kies een schone dissectie gerecht dat niet is blootgesteld aan fixatieven.
- Ontleden een zwervend 3 e instar Drosophila larven in Schneider Drosophila Medium met Ca 2 + en L-glutamine, (niet knippen geen zenuwen of schade spiervezels nrs. 7, 6, 13 of 12).
- Selecteer een glazen invulling pipet met een 12 micron tip (inwendige diameter).
- Met behulp van een spuit en slangen (negatieve druk uit te oefenen op de pipet) zorgen ervoor dat de pipet tip niet wordt belemmerd.
- Selecteer een fijne plastic vulling-filament die kunnen worden ingevoegd over de lengte van de glazen pipet.
- Teken ~ 1 cm van 5 mM dextran-geconjugeerd Ca 2 +-indicator in de plastic gloeidraad.
- Snij alle segmenten zenuwen.
- Ondersteuning van de pipet op een helling die het mogelijk maakt de pipet tip om het ventrale middellijn van het ontleed larve aanpak.
- Teken het afgesneden uiteinde van een zenuw te segmenteren No.4, zonder te knellen de zenuw, in het uiteinde van de pipet (inclusief een kleine hoeveelheid van het medium Schneider).
- Verwijder de slang en plaats de plastic gloeidraad in de pipet tot het einde van de gloeidraad wordt binnen 50 micron van het afgesneden uiteinde van de zenuw (vermijd het aanraken van de zenuw).
- Eject voldoende Ca 2 +-indicator op de zenuwuiteinden om het volume van het medium Schneider te verhogen met ongeveer 33% (uiteindelijke concentratie moet worden <2mm). Belangrijk - Dit moet binnen 5 minuten van het snijden van de zenuw.
- Plaats de bereiding in het donker bij kamertemperatuur, terwijl de zenuw wordt geladen.
- Na 40 minuten verwijderd van de Ca 2 +-indicator met behulp van de gloeidraad.
- Laat de pipet op zijn plaats en vullen met verse medium Schneider, omdat dit zal worden gebruikt om het stimuleren van pulsen van toepassing op de zenuw.
- Laat de Ca 2 +-indicator in de zenuw equilibreren voor ten minste 60 minuten, maar niet meer dan 4 uur, vóór de aanvang van Ca 2 +-imaging.
- Spoel het preparaat met medium verse Schneider elke 30 minuten tijdens het equilibreren.
- 20 minuten voor imaging vervangen Schneider medium met hemolymfe-Like No.6 oplossing (HL6; Macleod et al. 2002;. 2003).
- L-glutaminezuur of glutaminaat kunnen worden toegevoegd aan HL6 oplossing bij 7 mm aan de postsynaptische glutamaat receptoren ongevoelig voor zenuw opgewekte spiercontractie te voorkomen (Macleod et al., 2004;. Reiff et al., 2002;. 2005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
