Summary
Calcium ist ein allgegenwärtiges Botenstoff im Nervensystem, wichtig für die Auslösung die Freisetzung von Neurotransmittern und Veränderungen der synaptischen Stärke. Hier zeigen wir eine Technik zum Be-Ca 2 +-Indikatoren in Drosophila Nervenendigungen. Wir zeigen auch die Herstellung der erforderlichen Geräte und betonen Punkte von entscheidender Bedeutung für die Technik für den Erfolg.
Abstract
Calcium spielt viele Rollen im Nervensystem aber keiner eindrucksvoller als als Auslöser für die Freisetzung von Neurotransmittern, und niemand tiefer als wie der Bote essentiell für die synaptische Plastizität, dass Lernen und Gedächtnis unterstützt. Zur weiteren Aufklärung der molekularen Grundlagen der Ca 2 +-abhängige synaptische Mechanismen, ist ein Modell-System benötigt, das sowohl genetisch formbar und physiologisch zugänglich. Drosophila melanogaster bietet ein solches Modell. In diesem System sind genetisch kodierte fluoreszierende Indikatoren zur Verfügung Ca 2 + Änderungen in Nervenendigungen zu erkennen. Allerdings haben diese Indikatoren Empfindlichkeit gegenüber Ca 2 + beschränkt und zeigen oft ein nicht-lineares Ansprechverhalten. Synthetische fluoreszierenden Indikatoren sind besser für die Messung der schnellen Ca 2 + ändert sich mit Nerven-Aktivität assoziiert geeignet. Hier zeigen wir eine Technik zum Be-Dextran-konjugierten synthetischen Ca 2 +-Indikatoren in den Live-Nervenendigungen in Drosophila-Larven. Besonderes Augenmerk wird auf jene Aspekte des Protokolls am wichtigsten für die Technik für den Erfolg, wie, wie elektrostatische Entladungen entlang der isolierten Nerven zu vermeiden, die Erhaltung der Gesundheit der Zubereitung bei längeren Ladezeiten gelegt, und die Gewährleistung Axon Überleben durch Ca 2 + zur Förderung der Abdichtung von abgetrennten Axonendigungen. Geringe Affinität Dextran-konjugierten Ca 2 +-Indikatoren, wie Fluo-4 und rhod, zur Verfügung, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu zeigen, während minimal stören präsynaptischen Ca 2 + Dynamik. Dextran-Konjugation hilft zu verhindern, Ca 2 +-Indikatoren werden in Organellen wie Mitochondrien sequestriert. Die Belastung Technik kann auch für Larven, Embryonen und Erwachsenen angewendet werden.
Protocol
- Wählen Sie eine saubere Präparation Gericht, das nicht an Fixiermittel ausgesetzt wurde.
- Dissect ein wandernder 3 rd instar Drosophila Larve in Schneiders Drosophila Medium mit Ca 2 + und L-Glutamin, (nicht schneiden alle Nerven oder Schäden Muskelfasern Nr. 7, 6, 13 oder 12).
- Wählen Sie ein Glas füllen-Pipette mit einer 12 Mikrometer Spitze (Innendurchmesser).
- Mit einer Spritze und Schlauch (Unterdruck an die Pipette gelten) sicherzustellen, dass die Pipettenspitze nicht behindert wird.
- Wählen Sie eine feine Kunststoff-Füllung-Filament, das untergliedert werden können die Länge der Glaspipette eingebracht.
- Draw ~ 1 cm von 5 mM Dextran-konjugierten Ca 2 +-Indikator in der Kunststoff-Filament.
- Schneiden Sie alle Segment Nerven.
- Unterstützung der Pipette auf eine Rampe, damit die Pipettenspitze auf die ventrale Mittellinie des seziert Larve Ansatz.
- Zeichnen Sie das abgeschnittene Ende eines Nerven zu segmentieren No.4, ohne Quetschung der Nerven, in das Ende der Pipette (mit einer kleinen Menge von Schneider Medium).
- Entfernen Sie die Schläuche und die Kunststoff-Faden in die Pipette bis zum Ende des Fadens wird innerhalb von 50 Mikron das abgeschnittene Ende des Nervs (berühren Sie nicht die Nerven).
- Eject ausreichende Ca 2 +-Indikator auf die Nervenenden, um die Lautstärke des Schneiders Medium um etwa 33% (Endkonzentration sollte <2mm) zu erhöhen. Wichtig - Dies muss innerhalb von 5 Minuten des Schneidens den Nerv abgeschlossen sein.
- Ort der Vorbereitung im Dunkeln bei Raumtemperatur während die Nerven Lasten.
- Nach 40 Minuten entfernen Sie die Ca 2 +-Indikator mit dem Filament.
- Verlassen Sie die Pipette in Ort und füllen Sie es vollständig mit frischen Schneider-Medium, da dies zur stimulierende Impulse, um den Nerv zu beantragen.
- Lassen Sie die Ca 2 +-Indikator in den Nerv für mindestens 60 Minuten ausgleichen, aber nicht mehr als 4 Stunden vor Beginn der Ca 2 +-Imaging.
- Spülen Sie die Zubereitung mit frischen Schneider Medium alle 30 Minuten, während es ausgleichenden ist.
- 20 Minuten vor dem Imaging ersetzen Schneider-Medium mit Hämolymphe-Like No.6 Lösung (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
- L-Glutaminsäure oder Glutamat kann zu HL6 Lösung bei 7mm hinzugefügt werden, um postsynaptische Glutamatrezeptoren desensibilisieren, um Nerven-evozierten Muskelkontraktion verhindern (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
